譚雯文，秦 宇

(1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530003；2.廣西北部灣銀行南寧市東盟支行，廣西 南寧 530001)

不同方法提取菠蘿皮抑菌物質(zhì)的比較研究

譚雯文1，秦 宇2

(1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530003；2.廣西北部灣銀行南寧市東盟支行，廣西 南寧 530001)

采用超聲波水法提取、有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助有機(jī)溶劑提取等5種方法提取菠蘿皮的活性物質(zhì)，并選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及桔青霉等5種菌檢測(cè)菠蘿皮提取物的抑菌效果。結(jié)果表明，菠蘿皮提取物具有一定的抑菌作用，且其抑菌效果隨提取方式、菌種的不同而有差異。菠蘿皮抑菌物在偏酸條件下、經(jīng)紫外線照射、濕熱滅菌后仍具有良好的穩(wěn)定性。

菠蘿 皮；抑菌效果；提取方法

菠蘿又名鳳梨、黃梨、香波梨等，為鳳梨科鳳梨屬多年生草本果樹(shù)，是僅次于香蕉和芒果的世界第三大熱帶水果。菠蘿果肉中含大量還原糖、有機(jī)酸、維生素（VitBi，VitB2，VitC及VitE）、粗纖維，還含有鈣、鐵、鎂等易為人體吸收的微量元素[1-2]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

由于菠蘿不耐貯藏，大部分就地加工，產(chǎn)品由原來(lái)的糖水罐頭逐步發(fā)展到鮮果汁、濃縮汁和飲料。而菠蘿加工的副產(chǎn)物——菠蘿皮，占全果重量的50%～60%，同樣營(yíng)養(yǎng)豐富。分析測(cè)試表明菠蘿果皮渣中的水分、檸檬酸和總糖等成分比例與果肉相差無(wú)幾，粗蛋白和灰分的含量還高于果肉[3]。據(jù)報(bào)道，菠蘿皮可用于制備果酒，飲料、提取蛋白酶酚類(lèi)抗氧化劑、果膠[4-5]，但對(duì)于菠蘿皮提取物抗菌作用的研究，迄今鮮有報(bào)道。

本文采用不同提取方法提取菠蘿皮的抑菌物質(zhì)，比較其對(duì)常見(jiàn)食品污染菌的抑制作用，以期為菠蘿皮提取物在醫(yī)藥、食品等抗菌防腐的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿皮:將新鮮的菠蘿皮切片，于60℃恒溫干燥箱烘24h，粉碎后裝入密封袋室溫保存。

供試菌種:細(xì)菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

霉菌:黑 曲 霉（Aspergillus niger）、桔青 霉（Penicillium citrinum），以上菌種均由桂林理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基:大腸桿菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，霉菌采用馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基[6]。

HWS-24電熱恒溫水浴鍋，SWCJ-IF超凈操作臺(tái)，RE-2000A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TDZZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，DFY-800高速粉碎機(jī)，JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菠蘿皮抑菌物的提取

采用超聲波水提取、有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助有機(jī)溶劑提取等5種方法，結(jié)合各自最佳提取條件，并比較所得活性物質(zhì)的抑菌效果。

1.2.1.1 超聲波水提法

稱(chēng)取粉碎后的菠蘿皮10g，按料液比1∶25加水于具塞三角瓶中，超聲波（400W）作用20min，再在70℃恒溫水浴鍋中震蕩浸提1h，然后3000r·min-1離心5min，用紗布過(guò)濾，取清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至膏狀，再用蒸餾水溶解定容至10mL，其濃度為1000mg·mL-1（指1mL提取液相當(dāng)于1000mg

菠蘿皮干樣品），最后置于4℃冰箱中保存待用。

1.2.1.2 有機(jī)溶劑提取

稱(chēng)取粉碎后的菠蘿皮10g，按料液比1∶25加入75%乙醇于具塞三角瓶中，在70℃恒溫水浴鍋中震蕩浸提1h，然后離心、過(guò)濾、濃縮、定容，操作同1.2.1.1超聲波水提取方法。

同樣的方法分別以丙酮、乙酸乙酯作為提取劑，則分別得到丙酮提取液和乙酸乙酯提取液。

1.2.1.3 超聲波輔助有機(jī)溶劑提取

稱(chēng)取粉碎后的菠蘿皮10g，按料液比1∶25加入75%乙醇溶液于具塞三角瓶中，用超聲波（400W）作用20min，再在70℃恒溫水浴鍋中震蕩浸提1h，之后操作同1.2.1.1。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備

將5種供試菌種接入相應(yīng)的搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，細(xì)菌活化18h，霉菌活化40h，然后再將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到相對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。用接種環(huán)分別刮取一定量已活化好的菌種于9mL無(wú)菌生理鹽水中，充分搖勻，再用10倍稀釋法將菌懸液稀釋至含菌量為107CFU·mL-1的實(shí)驗(yàn)用菌懸液[7]。

1.2.3 提取物抑菌活性的測(cè)定

將15mL經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，待凝后加入0.1mL菌懸液于平板上，用無(wú)菌玻璃涂布棒將菌液涂布均勻，制成帶菌平板[8]。然后用無(wú)菌打孔器打出直徑為6mm的孔，在每個(gè)孔加入80 ?L菠蘿皮提取液，以無(wú)菌水做空白對(duì)照，平行3次。細(xì)菌于36℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于27℃培養(yǎng)48h。觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，比較不同提取方法對(duì)不同菌種的抑菌效果。

1.2.4 抑菌物穩(wěn)定性檢驗(yàn)

以大腸桿菌、黑曲霉為試驗(yàn)菌，利用超聲波輔助乙醇提取菠蘿皮抑菌物，比較提取液在不同條件下的穩(wěn)定性。

1.2.4.1 酸堿穩(wěn)定性

用稀鹽酸和稀氨水將提取液pH分別調(diào)為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，保持其濃度為1g·mL-1，參照1.2.3提取物抑菌活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟，以未調(diào)pH的提取液為對(duì)照，平行重復(fù)3次，測(cè)定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性

將提取液分別置于121℃、0.1MPa濕熱滅菌處理，參照1.2.3提取物抑菌活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟，以未處理的提取液為對(duì)照，平行重復(fù)3次，測(cè)定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

1.2.4.3 紫外穩(wěn)定性

將提取液置于紫外燈下照射0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，以未照射的提取液為對(duì)照，參照1.2.3提取物抑菌活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟，平行重復(fù)3次，測(cè)定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)不同菌種的抑菌效果

表1為不同提取方法的抑菌效果。圖1為不同提取溶劑的抑菌效果。從表1、圖1中可以看出，菠蘿皮中存在對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉都有抑菌作用的物質(zhì)。同樣的提取條件，抑菌物對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌作用優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌；抑菌物對(duì)黑曲霉有很明顯的抑制效果，而對(duì)桔青霉則無(wú)任何抑菌作用。不同的試劑，其提取液對(duì)供試菌的抑制程度有較大差異。有機(jī)溶劑提取的抑菌效果優(yōu)于水提取，對(duì)金黃色葡萄球菌的作用差別尤為明顯；而有機(jī)溶劑中，抑菌效果依次為乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯。

利用超聲波在液體中發(fā)生強(qiáng)烈的空穴作用使細(xì)胞破碎，增加其中有效成分的溶出速度和數(shù)量，能提高有效成分的浸提率。結(jié)果表明，超聲波乙醇復(fù)合作用的抑菌效果都要比單用乙醇提取的明顯很多，這和理論是相符的。由于菠蘿皮的抑菌物對(duì)大腸桿

菌和黑曲霉都有效果，因此之后的穩(wěn)定性試驗(yàn)以這兩種菌作為試驗(yàn)菌。

表1 不同提取方法的抑菌效果

圖1 不同提取溶劑的抑菌效果

2.2 抑菌物穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

以大腸桿菌、黑曲霉為試驗(yàn)菌，比較各種提取液在不同條件下的穩(wěn)定性。

2.2.1 酸堿穩(wěn)定性結(jié)果

不同pH條件下，菠蘿皮抑菌效果測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，菠蘿皮提取液在酸性條件下的抑菌效果比在堿性條件下好，抑菌物質(zhì)的抑菌效果隨著酸性增加而增強(qiáng)；黑曲霉受pH影響更明顯，在堿性條件下提取物喪失了對(duì)黑曲霉的抑制作用。菠蘿皮的抑菌物在酸性條件下比較穩(wěn)定，在堿性條件下抑菌活性物質(zhì)容易被破壞，pH大于10則喪失抑菌活性，由此推斷該成分可能為酸性物質(zhì)。

表2 不同pH對(duì)抑菌物穩(wěn)定性的影響

2.2.2 熱穩(wěn)定性結(jié)果

菠蘿皮提取液經(jīng)濕熱滅菌處理后的抑菌效果見(jiàn)表3。從表3可以看出，提取液在高溫滅菌后，對(duì)試驗(yàn)菌的抑制效果前后無(wú)明顯差別，說(shuō)明菠蘿皮的抑菌物具有良好的熱穩(wěn)定性。

表3 溫度對(duì)抑菌效果的影響

2.2.3 紫外穩(wěn)定性

菠蘿皮提取液經(jīng)紫外線照射后抑菌試驗(yàn)測(cè)得的抑菌圈大小見(jiàn)表4。由表4可以看出，當(dāng)提取物經(jīng)紫外線分別照射1.0h內(nèi)，抑菌圈大小基本沒(méi)有變化，照射1.5h后抑菌物活性有所下降，所以紫外線對(duì)抗菌活性物質(zhì)的活性有一定影響，但作用不大，說(shuō)明該抑菌物對(duì)紫外線基本穩(wěn)定。

表4 紫外線照射對(duì)抑菌物穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)果與討論

1 ) 實(shí)驗(yàn)證明了菠蘿果皮中含有抑菌物質(zhì)，以不同溶劑提取，所得提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等常見(jiàn)污染菌具有明顯的抑制作用，對(duì)桔青霉則無(wú)任何抑制作用。同一條件下，提取液對(duì)大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)。

2 ) 比較不同提取方法，有機(jī)溶劑提取的抑菌效果優(yōu)于水提取，有機(jī)溶劑中，抑菌效果依次為乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯。

3 ) 菠蘿皮抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該活性物質(zhì)經(jīng)紫外線處理、濕熱滅菌處理后仍保持良好的活性。抑菌物在酸性條件下穩(wěn)定，抑菌活性隨著酸性增強(qiáng)而增強(qiáng)；但在堿性條件下抑菌活性容易被破壞，在pH＞10時(shí)則失去活性，由此推斷抑菌活性物質(zhì)主要為酸性物質(zhì)。

[1] 王俊，巢炎，傅俊杰，等.輻照蘋(píng)果熱風(fēng)干燥工藝的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2001，27(5):579-582.

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Comparative Study of Different Extracting Methods for Antimicrobial Substances from Pineapple Peel

TAN Wen-wen1, QIN Yu2
(1.Guangxi Vocational and Technical Institute of Industory, Nanning,530001, China; 2.Guangxi Beibu Gulf Bank Nanning ASEAN Subbranch, Nanning 5301 05, China)

The active substances of pineapple peel was extracted by the methods of uitrasonic-assisted water extract, organic solvent extract and uitrasonic-assisted organic solvent extract, and its antimicrobial effect was detected by measuring the inhibition zones of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Aspergillus niger and Penicillium citrinum.The results showed that the extract of pineapple peel had a certain inhibitory effect, and its antimicrobial effects were different with differences of extracting methods and strains.The antimicrobial substance of pineapple peel had good stability under the meta-acid conditions, UV and moist heat sterillization.

pineapple peel; antimicrobial effect; extract methods

TQ 914.1

A

1671-9905(2015)02-00-

2011年度廣西教育廳科研立項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)201106LX785）；廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院2011年度學(xué)院重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目

譚雯文（1980-），女，講師，碩士，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與研究工作。

2014-11-11