易飛 Maya Valeska Gozali張家安 周炳榮 駱丹 張麗超 王申 劉娟 吳紅巾

氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）不僅對(duì)炎癥性痤瘡皮損有改善作用，對(duì)非炎癥性痤瘡皮損（如粉刺等）亦有顯著的改善作用［1-2］。此外，ALA-PDT療法在治療痤瘡的過(guò)程中，同時(shí)還作用于毛囊皮脂腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的角化過(guò)程，但是該作用機(jī)制尚未得到完全明確［3-5］。目前尚未在體外模型中進(jìn)行ALA-PDT療法對(duì)細(xì)胞過(guò)度角化的影響及其機(jī)制的研究。本研究以成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10（fibroblast growth factor 10，F(xiàn)GF-10）誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞過(guò)度角化及增殖模型為研究對(duì)象，探討ALA-PDT對(duì)該模型角化及增殖指標(biāo)的影響，初步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料與儀器

HaCaT細(xì)胞由上海長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科惠贈(zèng)。氨基酮戊酸粉劑（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，商品名為艾拉，批號(hào)130702），F(xiàn)GF-10（美國(guó)R&D system公司），胰酶（美國(guó)Amresco生物公司），培養(yǎng)基為含10%胎牛血清DMEM（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit 8，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），白細(xì)胞介素1α（IL-1α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國(guó)R&D system公司），兔抗人多克隆抗角蛋白 6（keratin-6，K6）、K16、K1 抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗人多克隆抗角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抗體（KGFR，美國(guó)Santa Cruz公司）。XD-635AB型光動(dòng)力激光治療儀（波長(zhǎng)635 nm，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），F(xiàn)V500型共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

二、方法

1.HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中。80%融合時(shí)以0.25%胰酶消化，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整為1×106/ml，定量接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待其貼壁長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.處理及分組：HaCaT細(xì)胞共分為4組，空白對(duì)照組（無(wú)任何處理），F(xiàn)GF-10組（加入FGF-10孵育24 h），ALA-PDT組（ALA孵育24 h后紅光照射），F(xiàn)GF-10+ALA-PDT組（FGF-10孵育24 h后，再加ALA孵育24 h后紅光照射）。FGF-10以薄層磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解后，-20℃避光保存，使用時(shí)吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞表面覆以PBS，加入濃度為100 μg/L的FGF-10，孵育24 h后吸除FGF-10，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。ALA溶液為現(xiàn)配的1 mmol/L ALA+DMEM培養(yǎng)液，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中避光培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍，加入1 ml PBS防止干涸，采用635 nm紅光照射，距離細(xì)胞10 cm，功率50 mW/cm2，光照后棄去原培養(yǎng)液，PBS洗3遍，吸盡液體。另外，在ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中，用不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組按上述要求處理后24 h進(jìn)行下面的檢測(cè)。

3.HaCaT細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：按上述分組處理后，每孔再加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，選擇波長(zhǎng)490 nm，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.Western 印跡法檢測(cè) K1、K6、K16、KGFR：經(jīng)上述分組處理后，分別提取細(xì)胞總蛋白，將蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），250 V 電壓下電泳 2 h，200 mA 100 V 轉(zhuǎn)印1 h，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉液中封閉，4℃過(guò)夜，棄去封閉液，不洗。封閉后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入一抗 K1（1∶10000）、K6（1∶5000）、K16（1 ∶1 000）、KGFR（1 ∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，再加入二抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶標(biāo)記抗體，用封閉液（1∶5 000）室溫下振蕩孵育2 h，顯色液室溫下顯色。用灰度分析軟件Image Tool 3.00進(jìn)行條帶分析。

5.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1α蛋白：空白對(duì)照組僅DMEM培養(yǎng)72 h；FGF-10組加DMEM培養(yǎng)24 h后，加入FGF-10孵育24 h，再換DMEM培養(yǎng)24 h；ALA-PDT組加DMEM培養(yǎng)48 h后,再加ALA孵育24 h后紅光照射；FGF-10+ALA-PDT組加DMEM培養(yǎng)24 h后加入FGF-10孵育24 h，再加ALA孵育24 h后紅光照射。照射紅光后需避光3 h。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒測(cè)定方法檢測(cè)上述各組細(xì)胞上清液IL-1α的含量，按操作說(shuō)明測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的A值。

6.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)KGFR和K6表達(dá)：將上述各組細(xì)胞用固定液固定10 min，洗滌后加入免疫封閉液封閉1 h，再洗滌后分別加入KGFR（1∶500）和 K6（1 ∶100）抗體，4 ℃過(guò)夜，次日洗滌后加入羊抗兔IgG，濕盒中避光孵育37℃1 h，洗滌后加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液對(duì)核進(jìn)行復(fù)染5 min，37℃避光染色，加入抗熒光淬滅劑封片觀察。用高倍鏡（×400）觀察樣品，DAPI由氬離子激光器358 nm激發(fā)，分辨率為1 024×1 024，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ALA-PDT對(duì)FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖的影響

析因分析顯示，各組經(jīng)處理后24 h，ALA-PDT和FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖無(wú)交互作用（F交互=1.369，P=0.276），F(xiàn)GF-10 對(duì) HaCaT 細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（F=20.853，P＜0.05），而ALA-PDT對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有抑制作用（F=24.822，P＜0.05）。FGF-10組細(xì)胞增殖活性（A值為1.233±0.099）較空白對(duì)照組（0.924±0.024）顯著升高（P＜0.05），而 ALA-PDT組細(xì)胞（0.718±0.107）較空白對(duì)照組則顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)GF-10+ALA-PDT組細(xì)胞增殖活性（0.901±0.014）與FGF-10組比較也顯著降低（P＜0.05）。

二、ALA-PDT對(duì)FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K1、K6、K16及 KGFR 表達(dá)的影響

Western印跡法結(jié)果顯示，ALA-PDT和FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達(dá)有交互作用（F交互值分別為 118.370、341.141、403.985、152.647，均P＜0.05），根據(jù)相加模型均判斷為負(fù)效應(yīng)。FGF-10促進(jìn)K1、K6、K16及KGFR蛋白表達(dá)（F值分別為 369.832、838.381、328.397、691.260，均P＜0.05），而ALA-PDT抑制這些蛋白的表達(dá)（F值分別為 407.319、919.896、788.253、571.337，均P＜0.05）。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，F(xiàn)GF-10組角蛋白K1、K6和K16及KGFR相對(duì)表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組（均P＜0.05），ALA-PDT組均顯著低于空白對(duì)照組（均P＜0.05），而FGF-10+ALA-PDT組顯著均低于FGF-10組（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1，表1。

圖 1 Western印跡法檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞角蛋白（K）1、K6、K16、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（KGFR）蛋白表達(dá)變化 1：空白對(duì)照組；2：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 10（FGF-10）組；3：ALA-PDT 組；4：FGF+ALA-PDT 組。FGF-10+ALA-PDT 組 K1、K6、K16、KGFR 蛋白表達(dá)水平與FGF-10組相比均明顯下降

表1 ALA-PDT與FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 ALA-PDT與FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。ALA-PDT：氨基酮戊酸光動(dòng)力療法；FGF-10：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10；K：角蛋白；KGFR：角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體。a：Western印跡法檢測(cè)；b：細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)

組別 灰度值a K 1 K 6 K 1 6 K G F R K 1 6 K G F R空白對(duì)照組 1.0 0 0±0.0 6 1 1.0 0 0±0.1 0 4 1.0 0 0±0.0 5 9 1.0 0 0±0.0 5 6 1 0.5 8 6±2.3 9 5 1 3.5 4 9±1.8 2 8 F G F-1 0組 2.2 9 8±0.1 3 1 3.4 3 8±0.0 9 2 2.9 3 2±0.0 2 4 2.6 3 9±0.1 2 5 7 8.2 8 6±4.7 4 0 7 0.4 2 9±2.3 9 1 A L A-P D T組 0.5 9 9±0.0 2 9 0.3 9 1±0.0 6 3 0.5 9 6±0.1 3 5 0.3 7 0±0.0 2 4 7.6 1 9±1.1 8 1 6.5 0 2±1.2 2 1 F G F-1 0+A L A-P D T組 0.9 5 9±0.0 2 4 0.9 3 0±0.0 9 2 0.4 9 6±0.0 9 1 0.8 9 2±0.0 7 2 1 8.4 6 8±2.9 0 1 4 2.7 8 0±2.0 8 1熒光強(qiáng)度b

圖2 激光共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞角蛋白6（K6）的免疫熒光圖像（×400） 藍(lán)色為4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液標(biāo)記，指示核區(qū)；綠色指示K6，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表達(dá)越高。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10（FGF-10）+ALA-PDT組K6熒光強(qiáng)度與FGF-10組相比明顯下降

圖3 激光共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（KGFR）的免疫熒光圖像（×400） 藍(lán)色為4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液標(biāo)記，指示核區(qū)；綠色指示KGFR，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表達(dá)越高。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10（FGF-10）+ALA-PDT組KGFR熒光強(qiáng)度與FGF-10組相比明顯下降

細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)顯示，ALA-PDT和FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞K6和KGFR免疫熒光強(qiáng)度有交互作用（F交互=173.174、85.561，均P＜ 0.05），且為負(fù)效應(yīng)。FGF-10可增強(qiáng)K6和KGFR免疫熒光強(qiáng)度（F值分別為 370.766、1 749.468，均P＜ 0.05），而ALA-PDT降低K6和KGFR免疫熒光強(qiáng)度（F值分別為 219.810、242.681，均P＜ 0.05）。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，F(xiàn)GF-10組K6和KGFR免疫熒光強(qiáng)度均顯著高于空白對(duì)照組（均P＜0.05），ALA-PDT組低于空白對(duì)照組（均P＜0.05），F(xiàn)GF-10+ALA-PDT組低于FGF-10組（均P＜0.05）。見(jiàn)圖 2、3，表1。

三、ALA-PDT對(duì)FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1α蛋白分泌的影響

ELISA法結(jié)果顯示，ALA-PDT和FGF-10對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-1α蛋白分泌無(wú)交互作用（F交互=0.006，P=0.939）。FGF-10 會(huì)增加 IL-1α 蛋白分泌（F=14.996，P＜0.05），而ALA-PDT對(duì)其沒(méi)有影響（F=0.584，P=0.467）。FGF-10組IL-1α 蛋白分泌水平（A值為0.282±0.029）顯著高于空白對(duì)照組（0.207±0.036），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ALA-PDT組（0.194±0.035）與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FGF-10+ALA-PDT組（0.266±0.031）顯著低于FGF-10組（P＜0.05）。

討 論

大量研究證實(shí)，F(xiàn)GF-10能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及過(guò)度角化［6］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-10能促進(jìn)毛囊導(dǎo)管上皮細(xì)胞過(guò)度角化，產(chǎn)生粉刺、炎癥等一系列改變［7］。有研究［4］認(rèn)為，當(dāng)給予適宜波長(zhǎng)的光進(jìn)行照射時(shí)，不僅可以激活痤瘡丙酸桿菌自身產(chǎn)生的內(nèi)源性卟啉，還能同時(shí)活化外源性ALA所轉(zhuǎn)換的PpIX（原卟啉IX），產(chǎn)生ROS，通過(guò)選擇性地殺傷痤瘡丙酸桿菌和破壞毛囊皮脂腺而改善痤瘡癥狀。然而，H?rfelt等［4］使用 20%ALA+ 不同紅光照射劑量方案治療后發(fā)現(xiàn)，明顯改善的痤瘡皮損中皮脂腺分泌水平和痤瘡丙酸桿菌的相對(duì)數(shù)量都沒(méi)有發(fā)生明顯改變，認(rèn)為ALA-PDT療法在改善痤瘡的過(guò)程中，可能同時(shí)還作用于毛囊皮脂腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的角化過(guò)程。我們通過(guò)前期研究和查閱文獻(xiàn)［8-9］，分別選擇 1 mmol/L ALA 和 100 μg/L FGF-10，孵育 3 h，紅光照射劑量為50 mW/cm2。在本實(shí)驗(yàn)中，HaCaT細(xì)胞經(jīng)FGF-10孵育后，與空白對(duì)照組相比，角蛋白K6、K16及K1表達(dá)增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了FGF-10確實(shí)可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度角化。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ALAPDT能下調(diào)FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K6、K16及K1蛋白的表達(dá)，提示ALA-PDT可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度角化及增殖。

大量研究表明，IL-1α能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度角化［10］，Guy 和 Kealey［11］在體外分離培養(yǎng)的毛囊皮脂腺導(dǎo)管模型中，加入1 μg/L IL-1α可以促進(jìn)毛囊皮脂腺導(dǎo)管的角化過(guò)度。此外，開放性粉刺中含有高濃度的IL-1α，在毛囊皮脂腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中IL-1α的濃度是其他組織的1 000倍［12］。毛囊皮脂腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞角化過(guò)度和增生過(guò)度常伴隨著K1、K6和K16的過(guò)度表達(dá)，IL-1α能通過(guò)自分泌方式誘導(dǎo)K1、K6和K16表達(dá)，激活基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞［13］。多種具有明確抗痤瘡作用的藥物（如異維A酸、抗雄激素藥物、過(guò)氧苯甲酰等）均可通過(guò)下調(diào)IL-1α表達(dá)來(lái)發(fā)揮療效［14］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，ALA-PDT能下調(diào)FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1α蛋白的表達(dá)，提示ALA-PDT調(diào)節(jié)角化異常的作用可能與抑制IL-1α的表達(dá)相關(guān)。

KGFR/FGFR2b信號(hào)通路也被認(rèn)為和毛囊漏斗部的過(guò)度角化有關(guān)［7，15-16］。KGFR/FGFR2b 是一類跨膜的酪氨酸激酶受體，有兩個(gè)亞型，分別是FGFR2b和FGFR2c。KGFR/FGFR2b主要分布在表皮的棘層和皮脂腺細(xì)胞，可與FGF-10特異性結(jié)合［17］。KGFR/FGFR2b受體蛋白激活后可啟動(dòng)下游通路，即激活磷脂酶C-蛋白激酶C（PLC/PKC）通路，其主要誘導(dǎo)IL-1α生成及后續(xù)過(guò)度角化進(jìn)程的發(fā)生。Melnik等［14］提出，過(guò)氧苯甲?？梢越到釱GFR/FGFR2b受體，從而對(duì)KGFR/FGFR2b信號(hào)通路下游機(jī)制和效應(yīng)發(fā)揮抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，使用免疫熒光和免疫印跡法均證實(shí)了ALA-PDT在FGF-10誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞過(guò)度角化過(guò)程中可以減少KGFR蛋白的表達(dá)。我們認(rèn)為ALA-PDT對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IL-1α分泌及細(xì)胞角化指標(biāo)的作用與其抑制KGFR/FGFR2b信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)，ALA-PDT可能通過(guò)KGFR/FGFR2b信號(hào)通路抑制FGF-10誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞過(guò)度角化及增殖，這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為解釋ALA-PDT治療非炎癥性皮損現(xiàn)象提供理論依據(jù)，但仍需進(jìn)一步的體內(nèi)外研究予以深入研究。

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