劉盟盟，賈 麗，張洪芹，臧曉琳，張汝民，高 巖

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安311300）

機械損傷對冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物的影響

劉盟盟，賈 麗，張洪芹，臧曉琳，張汝民，高 巖

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安311300）

為了探討放牧過程中的采食和踐踏損傷對草原植物冷蒿Artemisia frigida次生代謝產(chǎn)物的影響，對盆栽的內(nèi)蒙古草原冷蒿進行不同程度的機械損傷處理（以剪刀損傷和揉捏），設置輕度（處理1/4枝條）、中度（處理1/3枝條）、重度損傷（處理1/2枝條）水平和對照，利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析了不同處理后冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物的變化。結(jié)果表明：機械損傷處理后，冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物的總量在一定的時間范圍內(nèi)增加，輕度處理后次生代謝產(chǎn)物含量的增加較緩慢且峰值出現(xiàn)晚，而中度和重度處理后次生代謝產(chǎn)物的含量迅速增加，在6 h時達到峰值而后出現(xiàn)下降的現(xiàn)象；輕度和中度處理次生代謝產(chǎn)物種類增加，重度處理則減少。冷蒿的次生代謝產(chǎn)物主要是萜烯類化合物，占總量的80%以上；各處理萜烯類化合物含量與對照比分別增加了59%，54%，67%，其中，8-羥基里哪醇的增加趨勢最為明顯；酚類、醇類、芳香烴和酮類化合物的含量在處理后也有一定程度的增加。圖5表1參23

植物化學；機械損傷；冷蒿；次生代謝產(chǎn)物；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

植物次生代謝產(chǎn)物（也稱次生產(chǎn)物、次生物質(zhì)）是指植物中一大類對于細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常進行并非必需的小分子有機化合物，有自己獨特的代謝途徑，通常由初生代謝派生而來［1］。在植物對物理、化學環(huán)境的反應和適應，植物與植物之間的相互競爭和協(xié)同進化，植物對昆蟲、草食動物甚至人類的化學防御以及植物與微生物的相互作用等過程中，次生代謝產(chǎn)物都起著重要作用［2］。面對動物和人類的采食或損傷，植物通過改變生理生化代謝途徑增加體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，形成大量的萜烯類、酚類和生物堿等化合物，增加自身的化學防御能力［3］。早期研究已發(fā)現(xiàn)，損傷植物的葉片中總酚含量有顯著增加［4］；嚴善春等［5］和袁紅娥等［6］研究表明：興安落葉松Larix gmelinii針葉經(jīng)剪葉和松毛蟲Dendrolimus punctatus取食后，酚酸化合物與縮合單寧含量迅速增加。大多數(shù)植物在遭受植食性動物攻擊或機械損傷時，其次生代謝產(chǎn)物會發(fā)生變化［7］。任琴等［8］指出，人工剪葉后馬尾松Pinus massoniana揮發(fā)物各種成分相對含量都有所升高。一些低分子量的萜類物質(zhì)是植物受食草動物取食后誘導釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中的主要成分［9-11］。冷蒿Artemisia frigida為菊科Compositae蒿屬Artemisia的多年生小半灌木，抗風蝕、耐踐踏，廣布于內(nèi)蒙古草原帶和荒漠草原帶，是草原群落的主要建群植物之一，也是其他草原群落的伴生植物種或亞優(yōu)勢植物種。研究表明：冷蒿莖葉浸提液主要成分是樟腦、龍腦、蓍草苦素、桉樹腦、喇叭烯醇和對-1-薄荷烯-4-醇等化合物［12-13］；其釋放揮發(fā)性有機化合物（VOCs）主要成分是桉樹腦、莰烯、（E）-乙酸-3-己烯酯、α-萜品醇、對-傘花烴和樟腦［14］，這些揮發(fā)物和莖葉浸提液能夠影響植物種子萌發(fā)與幼苗生長發(fā)育，且損傷較未損傷冷蒿 VOCs的抑制作用增強［12-13,15］。張汝民等［16］研究指出：冷蒿釋放的揮發(fā)性有機化合物如1,8-桉樹腦、α-蒎烯、α-萜品醇等，具有抑制綿羊Ovis aries采食的作用。因此，本研究對盆栽的內(nèi)蒙古草原野生冷蒿進行不同程度的機械損傷處理，利用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）聯(lián)用技術(shù)分析了不同的損傷強度下冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物的變化，為探討放牧過程中的采食和踐踏損傷對草原植物冷蒿次生代謝產(chǎn)物的影響，揭示草原植物冷蒿的耐牧性及其成為草原生態(tài)環(huán)境中重要保護者的原因提供新的資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料冷蒿采自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林浩特毛登牧場內(nèi)蒙古大學草地生態(tài)學研究基地，地理位置為44°10′2′′N，116°28′56′′E，海拔1 160 m。全年平均氣溫為-0.4℃，最冷月（1月）平均溫度-22.3℃，最熱月（7月）平均氣溫18.8℃，≥0℃年積溫為2 410℃，≥10℃積溫為1 597.9℃，無霜期91 d，草原植物生長期為150 d左右。全年平均降水量為365.6 mm，集中于6-9月，約占全年降水量的80%。本研究區(qū)域主要草原植物為羊草Leymus chinensis，糙隱子草 Cleistogenes squarrosa，克氏針茅Stipa krylovii，大針茅S.grandis，防風Saposhnikovia divaricata，冷蒿Artemisia frigida，瓣蕊唐松草Thalictrum petaloideum，阿爾泰狗哇花Heteropappus altaicus等。土壤為栗鈣土。

1.2 材料處理

2014年6月中旬在采樣地挖取生長健壯的冷蒿植株，栽植于盛有采樣地原土的花盆中（直徑18 cm，高20 cm），1叢·盆-1，苗高20 cm，10～15小枝·叢-1。盆栽苗置于浙江農(nóng)林大學植物生理生化實驗室萊福PQX多段可編程人工氣候箱中，白天光照12 h，光強為500 μmol·m-2·s-1，溫度為25℃，夜間溫度20℃，相對濕度為（30±2）%，緩苗生長20 d后進行實驗處理。選取株高一致、生長良好、無病蟲害冷蒿36盆，隨機分為4組，以剪刀損傷和揉捏方式人工模擬牲畜對冷蒿葉片的采食和踐踏，處理1/4枝條為輕度損傷、處理1/3枝條為中度損傷、處理1/2枝條為重度損傷、不作處理為對照。每個損傷強度和處理時間分別處理3盆，1盆為1個獨立重復。分別在處理后0，6，12，24 h取樣，對冷蒿葉片進行取樣，液氮速凍后放置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷蒿葉片次生代謝物的提取 采用浸提法，準確稱取冷蒿葉片1.0 g（3～4個小枝），剪為0.5 cm小段，置于10.0 mL離心管中，加入7.0 mL蒸餾水，置于搖床上（100 r·min-1），在25℃條件下浸提48 h，經(jīng)4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，得到冷蒿葉片水浸提液。

1.3.2 化學成分分析 取5.0 mL冷蒿葉片水浸提液，加入1.0 mL乙酸乙酯萃取，取出酯相，重復3次，合并酯相，氮氣吹干，然后加入200.0 μL乙酸乙酯充分溶解，取1.0 μL進樣，作GC-MS分析。儀器及參數(shù)設置條件：GC（7890A型，Agilent，Wilmington，美國）條件：色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50℃，以6℃·min-1的速率升至180℃，保持2 min，再以10℃·min-1升到250℃，保持10 min；載氣為He，流速0.8 mL·min-1；進樣口溫度280℃。MS（5975C型，Agilent，Wilmington，美國）條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；傳輸線溫度250℃；掃描質(zhì)量范圍28～450。上樣量為1.0 μL。采用NIST 2008譜圖庫兼顧色譜保留時間定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀計算機的NIST 2008譜庫，結(jié)合計算機檢索與手工檢索，并根據(jù)已報道的植物次生代謝產(chǎn)物保留時間對其各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行定性分析，以色譜峰面積進行定量分析，并計算其各組分的相對含量。采用Origin進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 機械損傷對冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物成分的影響

采用GC-MS方法對冷蒿葉片乙酸乙酯萃取物的成分進行檢測分析，共檢測出了43種化合物，包括萜烯類、醇類、酚類、芳香烴類和酮類（表1）。未損傷對照組檢測出次生代謝產(chǎn)物27種，總峰面積為263.9。其中萜烯類化合物18種，相對含量占總量的86.6%；酚類化合物4種，占總量的10.0%；醇類化合物3種；芳香烴類化合物1種；酮類化合物1種。主要成分有雪松醇、8-羥基里哪醇、鐮葉芹醇、脫氫芳樟醇和樟腦，占總量的66.8%。

以處理6 h為例，輕度損傷檢測出27種次生代謝產(chǎn)物，其中萜烯類和酚類化合物為主要的次生產(chǎn)物種類，峰面積占總峰面積的91.1%；主要含有8-羥基里哪醇、布枯樟腦、脫氫芳樟醇、反-異丁香酚、香茅醛，占總量的59.5%；與對照相比，減少了菊油環(huán)酮、反-法尼醇、檀香腦、鐮葉芹醇，增加了2,4-己二烯-1-醇、4-萜品醇、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3-醇、2,6-二甲基萘。中度損傷含有26種次生代謝產(chǎn)物，總峰面積（444.5）是對照的1.68倍，萜烯類和酚類化合物占總量的90.2%；主要成分有8-羥基里哪醇、脫氫芳樟醇、鐮葉芹醇、芳樟醇、樟腦，占總量的67.9%；與對照相比，菊油環(huán)酮、反-法尼醇、雪松醇、喇叭茶醇、檀香腦為減少的物質(zhì)，4-萜品醇、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3-醇、枯茗醇、2,6-二甲基萘為增加的物質(zhì)。重度損傷檢測到25種次生代謝產(chǎn)物，總峰面積（480.7）最大，是對照的1.82倍，其中萜烯類和酚類化合物占總量的89.0%；主要成分包括8-羥基里哪醇、環(huán)氧芳樟醇、反-法尼醇、脫氫芳樟醇、龍腦，占總量的60.4%；與對照相比，減少了樟腦、薰衣草醇、布枯樟腦、檀香腦4種物質(zhì)，但增加了原冰片、順-香芹醇、馬鞭草烯醇等3種物質(zhì)。

2.2 機械損傷后冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物各類化合物的含量變化

2.2.1 萜烯類的變化 從圖1來看：對照萜烯類峰面積為228.6；輕度損傷隨時間的增加基本保持逐漸增加的趨勢，并在24 h時達到峰值，與對照相比增加了59%；中度和重度損傷均為先增加后減少的變化趨勢，且在6 h時含量最高，與對照相比增加了54%和67%。雪松醇在對照中含量最高，損傷后急劇減少或消失，其在對照中的含量分別是輕度和重度損傷的7.8和10.5倍，中度損傷中一直未檢測到。8-羥基里哪醇在損傷后均增加，變化趨勢與萜烯類總含量的變化一致，在輕度、中度和重度損傷中的含量分別比對照增加了2.5，2.3和1.5倍。桉樹腦、芳樟醇、環(huán)氧芳樟醇、松油烯-4-醇、脫氫芳樟醇、順-萜品醇、8-羥基里哪醇等物質(zhì)隨著損傷強度的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢；樟腦、龍腦和鐮葉芹醇則為先減后增的趨勢。3-蒈烯、檸檬烯、藏紅花醛、菊油環(huán)酮、順-香芹醇、1,4-桉樹腦、馬鞭烯酮和橙花叔醇等物質(zhì)僅在損傷處理中出現(xiàn)，為新增的萜烯類化合物。

2.2.2 酚類的變化 在不同損傷程度的處理中，酚類化合物的峰面積隨時間的變化規(guī)律有很大差異（圖2）。對照峰面積為26.48；輕度損傷隨著時間的延長逐漸增加至24 h達到最高，比對照增加了60%；中度損傷在6 h時含量最高，峰面積比對照增加了近1.0倍，然后則隨時間增加而逐漸降低，依次為45.61和18.11；重度損傷依次為46.35，62.10和36.60，呈現(xiàn)出先增加后減少的現(xiàn)象，最大值出現(xiàn)在處理后12 h，達到了對照的2.3倍。苯酚的峰面積表現(xiàn)出與酚類總峰面積一致的變化，隨著處理強度的增加而增大，輕度、中度和重度損傷與對照相比分別增加了1.1，2.0和3.3倍；愈創(chuàng)木酚和反-異丁香酚的峰面積隨損傷強度的增加呈顯著先增加后減少的趨勢，輕度損傷比對照增加了1.5和2.2倍，中度

損傷比對照增加了1.7和4.7倍，重度損傷比對照增加了0.8和3.3倍；杜烯酚則只在重度損傷中略有增加，24 h時比對照增加了69%，其他處理中略有減少。

表1 機械損傷后冷蒿葉片次生代謝產(chǎn)物的組分變化Table1 Changes of the main components of secondary metabolites from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

表1 （續(xù)）Table1 Continued

2.2.3 醇類的變化 從圖3可以看出，損傷處理后，醇類化合物的含量較對照都有增加。不同損傷強度處理的峰面積變化規(guī)律不盡相同，輕度損傷隨時間變化呈一直增加的趨勢，24 h時總峰面積達到對照的5.4倍；中度和重度損傷呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，均在6 h最高，達到對照的5.9和5.7倍。2,3-丁二醇和苯甲醇的含量在損傷后明顯增加，6 h時輕度損傷達到對照的3.0和1.6倍，24 h上升到5.8和11.6倍，中度損傷與對照相比最高增加了3.7和15.0倍，重度損傷最高增加了5.6和14.4倍。2,4-己二烯-1-醇、1-己醇、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3-醇在對照中未檢測到，僅出現(xiàn)在損傷處理組中。

圖1 機械損傷后冷蒿葉片萜烯類化合物的含量變化Figure 1 Changesofthe contentsof terpenoids from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

圖2 機械損傷后冷蒿葉片酚類化合物的含量變化Figure 2 Changes of the contents of phenols from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

圖3 機械損傷后冷蒿葉片醇類化合物的含量變化Figure 3 Changes of the contents of alcohols from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

2.2.4 其他化合物的變化 除萜烯類、酚類和醇類化合物外，本研究還檢測出了芳香烴類和酮類化合物。芳香烴類化合物的含量在損傷后12 h內(nèi)迅速增加（圖4），與對照相比均增加1倍以上，輕度損傷在12 h后急劇下降，中度和重度損傷在12 h后變化不明顯；2,6-二甲基萘僅在損傷處理后出現(xiàn)，在損傷強度水平上先增后減，在處理時間水平上則保持增加的趨勢。酮類化合物僅有1種，其含量在損傷后明顯增加，輕度損傷隨處理時間一直呈增加的趨勢，24 h時峰面積較對照增加了4.6倍；中度和重度損傷則先增加后減少，且均在6 h達到最大值，與對照相比分別增加了6.1和4.8倍（圖5）。

圖4 機械損傷后冷蒿葉片芳香烴化合物含量變化Figure 4 Changes of the contents of aromatics from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

圖5 機械損傷后冷蒿葉片酮類化合物的含量變化Figure 5 Changes of the contents of ketones from the leaves of Artemisia frigida under mechanical damage

3 討論

植物雖不能像動物一樣通過改變位置主動躲避放牧家畜的采食和踐踏損傷，但在長期的自然選擇進化過程中也獲得了一些避免或減弱傷害的化學武器，以主動適應生存環(huán)境。植物通過調(diào)控次生代謝途徑，產(chǎn)生生物化學防御物質(zhì)是一種有效的策略［3］，能夠增加植物的抗性。有研究表明：動物的活動能夠影響植物組成性和誘導性釋放的VOCs中物質(zhì)的相對比例［17-18］。Kang等［19］提出，許多植物在受到損傷時釋放單萜以抵御動物采食或者損傷，作為防御物質(zhì)增加抵抗能力；張汝民等［16］研究表明：綿羊采食時，對牧草的種類、氣味具有一定的選擇，冷蒿葉片釋放的揮發(fā)物中的1,8-桉樹腦、α-蒎烯、α-萜品醇等萜類物質(zhì)使綿羊?qū)δ敛莸牟墒沉匡@著下降；對傘花烴、樟腦和異丁烯醛［20］也被報道能夠顯著抑制羔羊的食物攝入。本研究結(jié)果中，冷蒿經(jīng)機械損傷后，葉片中8-羥基里哪醇、桉樹腦、芳樟醇、龍腦、松油烯-4-醇等萜類化合物的含量顯著增加，可能是冷蒿損傷后調(diào)控了次生代謝途徑，體內(nèi)形成了防御性萜烯類物質(zhì)，可以作為氣味的驅(qū)拒劑，抵御動物采食，與前面的研究報道具有一致性。冷蒿遭受損傷后，次生代謝產(chǎn)物方面另一個明顯的變化是酚類化合物含量的增加，苯酚、愈創(chuàng)木酚和反-異丁香酚等隨損傷強度的增加呈顯著增加趨勢，這被認為是創(chuàng)傷誘導的氧化反應，即產(chǎn)生有毒的單元酚或雙元酚和酮類化合物，抵御動物采食和損傷，或者參加木質(zhì)素代謝，增加植物的硬度以減弱損傷。左照江等［14］的研究表明：冷蒿在損傷時釋放出大量己醇類脂肪酸衍生物，如3-己烯醇，這些物質(zhì)能抵御草食性昆蟲的侵害。機械損傷后冷蒿葉片中含有的醇類化合物含量升高，且2,4-己二烯-1-醇、1-己醇是在損傷處理后新增的物質(zhì)，可能是為釋放醇類化合物以抵御傷害提供基礎。

積極防御假說（active defense hypothesis，ADH）認為，植物只有在其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物所獲得的防御收益大于其生長所獲得的收益時才產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。面臨脅迫時，植物次生代謝產(chǎn)物的防御收益增加，因而產(chǎn)生的次生產(chǎn)物較多［21］。本研究中在中度和重度損傷處理后，冷蒿葉片受害嚴重，其次生代謝產(chǎn)物的含量迅速增加，萜類、酚類等各類化合物的含量增加反應也很明顯。食草動物取食后，植物體內(nèi)樹脂管或腺毛等預先儲存VOCs的結(jié)構(gòu)破裂，導致?lián)]發(fā)物釋放的結(jié)果［22］，也可以是受損器官或附近未受損器官從頭合成的物質(zhì)在幾小時或幾天后的釋放。本研究中，輕度損傷后萜烯類、酚類、醇類和酮類化合物含量的增加較緩慢且峰值出現(xiàn)都最晚，而中度和重度損傷后次生代謝產(chǎn)物的含量迅速增加，在6 h或12 h達到峰值后出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，這可能與莖葉揮發(fā)、根系分泌有一定的關(guān)系。

許多研究表明：對植物葉片的人為損傷也能導致VOCs釋放水平的升高，對食草動物采食產(chǎn)生趨避作用［23］。當機械損傷的區(qū)域和時間跨度達到實際取食的水平，VOCs釋放圖譜與許多物種被取食后得到的圖譜很相似。盡管如此，一些草食動物的代謝物，如脂肪酸-氨基酸結(jié)合物、硫酸化的脂肪酸衍生物、肽和β-葡糖苷酶，還是能夠特異性影響VOCs的釋放。與此類似，自然放牧條件下食草動物的活動也可能會導致冷蒿形成特異性的次生代謝產(chǎn)物。本研究探討了人為機械損傷對冷蒿次生代謝產(chǎn)物的影響，而次生代謝產(chǎn)物在冷蒿耐牧性中的具體作用還需要進行更深一步的研究。

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Mechanical damage on secondary metabolites from Artemisia frigida leaves

LIU Mengmeng,JIA Li,ZHANG Hongqin,ZANG Xiaolin,ZHANG Rumin,GAO Yan
（School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To determine the effects of feed intake and trample damage on secondary metabolites of Artemisia frigida,A.frigida from Inner Mongolia grassland was potted in the laboratory and treated with different degrees of mechanical damage （light,moderate,severe,and a control group without damage）.Then chemical components of the leaves were analyzed by gas chromatography/mass spectrometry （GC-MS）.Results showed that with mechanical damage treatment the total amount of secondary metabolites increased within a certain time range.Secondary metabolites with light damage increased gradually and peaked at 24 h;moderate and severe treatments increased rapidly,peaked at 6 h,and then declined.Increases in species of secondary metabolites were visible when treated with light and moderate damage,but a decrease appeared with severe damage.The main components of secondary metabolites were terpenoids which accounted for more than 80%of the total.The terpenoid content when compared with the control increased 59%with light damage,54%with moderate damage,and 67%with heavy damage.The increase of 8-hydroxylinalool was greatest;however,phenols,alcohols,aromatics,and ketones also increased.［Ch,5 fig.1 tab.23 ref.］

plant chemistry;mechanical damage;Artemisia frigida;secondary metabolites;gas chromatography/mass spectrometry（GC-MS）

S718.43；Q946.8

A

2095-0756（2015）06-0845-08

浙 江 農(nóng) 林 大 學 學 報，2015，32（6）：845-852

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.06.004

2015-01-07；

2015-03-21

國家自然科學基金資助項目（31270756，31470704）

劉盟盟，從事植物生理生化研究。E-mail：liumeng8880@163.com。通信作者：高巖，教授，博士，從事植物生理生態(tài)等研究。E-mail：gaoyan1960@sohu.com