付青梅 張永創(chuàng) 張永春 卜英博 謝淼 王茜

（1.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院；2.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科；3.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院外二科；4.武警

貴州省總隊(duì)醫(yī)院設(shè)備科；5.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科；6.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)二科，貴州 貴陽(yáng)550005）

海洛因吸食在世界范圍內(nèi)已成為一種嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題，海洛因、嗎啡等阿片類毒品長(zhǎng)期濫用可引起細(xì)胞變性、壞死，其對(duì)人體細(xì)胞免疫功能的損傷已被證實(shí)［1］。目前針對(duì)海洛因吸食的研究眾多，但對(duì)海洛因吸食者T淋巴細(xì)胞線粒體產(chǎn)能代謝功能的報(bào)道甚少，且大部分為體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究。故本實(shí)驗(yàn)從不同海洛因吸食年限患者體內(nèi)抽取外周血，提取T淋巴細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，旨在從線粒體層面探討海洛因?qū)θ薚淋巴細(xì)胞線粒體產(chǎn)能代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對(duì)象為武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院戒毒中心選擇的100例青、中年男性海洛因吸食者，抽取其外周血備用；無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液（DHank’s液，pH7.2～7.4）；淋巴細(xì)胞分離液（天津市TBD生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品）；RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO產(chǎn)品）；小牛血清（華西醫(yī)科大學(xué)生產(chǎn)）；尼龍棉（上?；w九廠）；MTT（Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法如下。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 從我院戒毒中心隨機(jī)選擇100例男性青中年海洛因吸食者，據(jù)入院前的綜合體檢，排除其他疾病；根據(jù)海洛因吸食時(shí)間，將受試對(duì)象分為2年、5年、8年3個(gè)組別，實(shí)驗(yàn)前告知所有受試對(duì)象該研究的目的和意義，并選擇20例健康成年男性的外周血作為對(duì)照。3組患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)為20～25歲（年齡標(biāo)準(zhǔn)差在±6.21以內(nèi)）的吸毒者，且排除其他系統(tǒng)性疾病，無慢性病史。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離 采用密度梯度離心法，取新鮮上述組別外周血，用DHank’s液稀釋2～3倍，充分混勻后用無菌毛細(xì)吸管吸取5～6mL稀釋的細(xì)胞懸液沿管壁小心緩慢地加入預(yù)先已裝有3mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管內(nèi)，水平式轉(zhuǎn)頭2 000 r／min離心20min，絕大多數(shù)PBMCs懸浮于血漿與分層液界面上，將此層移入另一試管。用5倍以上體積的D－Hank’s液充分 洗 滌，1 600 r／min 離 心 8min，棄 上 清；1 000 r／min離心10min，棄上清液，以去除混雜的血小板，所得PBMCs重懸于含100mL／L胎牛血清蛋白（FCS）的RPMI 1640培養(yǎng)基中備用。

1.2.3 PBMCs中淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的分離采用玻璃器黏附法，將分離的PBMCs細(xì)胞數(shù)調(diào)至2×106個(gè)／mL，置于120mm玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，充分搖晃混勻，于50mL／L CO2孵箱中37℃靜置60～90min后，以毛細(xì)吸管小心輕吸未黏附之細(xì)胞懸液，即為去除單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞的分離純化 采用尼龍棉柱濾過法，尼龍棉以0.2mol／L HCl浸泡6h，再用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，晾干。稱取尼龍棉50mg將其裝填入10mL注射器內(nèi)，高壓滅菌。尼龍棉柱高度為6cm，可有效地過濾（2～3）×107個(gè)細(xì)胞。用DHank’s液和含200mL／L FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗柱各2次，以平衡pH、溫度、排除空氣，37℃放置1h。上柱前先將平衡液放出，加入細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)／mL的淋巴細(xì)胞懸液0.5mL，平放尼龍棉柱，以細(xì)長(zhǎng)的毛細(xì)滴管伸入柱內(nèi)界面加入培養(yǎng)液0.5mL封口，將柱于37℃靜置孵育1h。用預(yù)溫的培養(yǎng)液淋洗柱2～3次，流速控制在1mL／min，收集最初的10mL流出液，1 300 r／min離心10min，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，此即分離純化T淋巴細(xì)胞。

1.2.5 T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 將分離的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含200mL／L FCS、2mmol／L 谷氨酰胺、20mmol／L N－2－羥 乙 基 哌 嗪－N’－2－乙 烷 磺 酸（HEPES）、100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)／mL。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 將分離所得的T淋巴細(xì)胞按2×105個(gè)／mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入上述培養(yǎng)基1.5mL培養(yǎng)4h后，部分轉(zhuǎn)入96孔板內(nèi)（104個(gè)／孔），48h后小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入80μL無血清培養(yǎng)基和20μL MTT溶液（5μg／L），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸取孔內(nèi)液體，每孔加150μL二甲基亞砜，低速震蕩10min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的吸光度值。吸光度值反映細(xì)胞增殖活性，其高低與細(xì)胞增殖活性成正比。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，用不含EDTA的胰酶消化后離心收集細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)約為2.5×106個(gè)，棄培養(yǎng)基，使用PBS洗滌細(xì)胞2次，分別依次加入500μL Binding Buffer、5μL Annexin V－FITC、5μL Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)15min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè) 細(xì)胞處理后，消化離心收集細(xì)胞，加無血清培養(yǎng)基520μL混勻，加2%三氯醋酸520μL，冰浴5min，離心5min后取300μL上清與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）液300μL和磷酸甘油醛脫氫酶－磷酸甘油激酶10μL混合，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)NADH下降的吸光度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查ATP值。

1.2.9 活性氧（ROS）的 DCFH－DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞，加入終濃度為10μmol／L的 DCFH－DA，于37℃ 培養(yǎng)箱中孵育30min。孵育結(jié)束后，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH－DA，再次收集細(xì)胞后，PBS重懸，用熒光分光光度汁測(cè)定2＇，7＇－二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的光柵寬度均設(shè)為5nm。ROS含量與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（ˉx±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同海洛因吸食年限者T淋巴細(xì)胞增殖活性對(duì)照組測(cè)得平均熒光強(qiáng)度值為（0.74±0.06），海洛因吸食2年者測(cè)得值為（0.57±0.04），吸食5年者測(cè)得值為（0.35±0.05），吸食8年者測(cè)得值為（0.27±0.02）。與對(duì)照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細(xì)胞增殖活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 不同海洛因吸食年限者T淋巴細(xì)胞凋亡情況海洛因吸食對(duì)T淋巴細(xì)胞凋亡影響后Annexin V－FITC／PI雙染結(jié)果是對(duì)照組測(cè)得其細(xì)胞凋亡率為（6.20±1.14）%，海洛因吸食2年者測(cè)得值為（10.28±1.51）%，吸食5年者測(cè)得值為（22.17±2.13）%，吸食8年者測(cè)得值為（29.78±2.89）%。與對(duì)照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細(xì)胞凋亡程度逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 不同海洛因吸食年限對(duì)T淋巴細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生的影響 對(duì)照組測(cè)得其T淋巴細(xì)胞線粒體的ATP含量為（0.136±0.021）mmol，海洛因吸食2年者測(cè)得其含量為（0.113±0.009）mmol，吸食5年者測(cè)得其含量為（0.083±0.008）mmol，吸食8年者測(cè)得其含量為（0.062±0.003）mmol。與對(duì)照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 DCFH－DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量與各自對(duì)照組比較，隨著亞硒酸鈉劑量的增加，細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度逐漸減低。相同劑量亞硒酸鈉干預(yù)的不同組間比較，隨著海洛因吸食時(shí)間的增加，細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。說明亞硒酸鈉可使細(xì)胞ROS含量降低；而吸食海洛因可使細(xì)胞內(nèi)

ROS含量升高。見表1。

表1 亞硒酸鈉對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

3 討 論

有研究［2］發(fā)現(xiàn)海洛因吸食成癮可導(dǎo)致人體免疫功能受損，且海洛因成癮為造成細(xì)胞死亡的主要形式。早期報(bào)告亦指出，藥物濫用能抑制外周血T細(xì)胞的E－花環(huán)形成，毒品依賴者外周血T細(xì)胞減少，絲裂原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖能力下降，同時(shí)，藥物濫用不僅對(duì)細(xì)胞增殖方面產(chǎn)生影響，其能使吸食者體內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變［3］。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ又稱CoQ還原酶，復(fù)合物Ⅰ缺陷或者抑制導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜質(zhì)子電化學(xué)梯度異常，ATP合成障礙以及增加氧自由基損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在前人的研究中有證明海洛因?qū)е铝松餇顟B(tài)及抗氧化酶活性的變化，活性氧（ROS）和一些疾病有關(guān)，細(xì)胞在生理或者病理狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生ROS，當(dāng)氧化和抗氧化的臨界平衡由于抗氧化劑耗盡和（或）過量的ROS堆積被打破時(shí)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生。ROS可以和一些大分子發(fā)生反應(yīng)，如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合物，特別是膜上的多不飽和脂肪酸。當(dāng)ROS反應(yīng)開始后，持續(xù)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)會(huì)造成細(xì)胞損傷，最終細(xì)胞死亡［4］。有研究［5］表明，正常人與海洛因吸食患者外周血白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性，結(jié)果顯示兩組之間線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性有顯著差異，海洛因吸食者細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性明顯低于正常對(duì)照組，因此，本研究從海洛因不同吸食年限的人群中，抽取外周血，提取T淋巴細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量發(fā)現(xiàn)，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生逐漸減少，這可能與海洛因吸食者線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性低于正常對(duì)照組有關(guān)，亦因線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ缺陷從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜質(zhì)子電化學(xué)梯度異常，ATP合成障礙從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；通過檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡發(fā)現(xiàn)，隨著海洛因吸食年限的增加，人體外周血中T淋巴的凋亡逐漸增加，細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，這可能是海洛因在人體T淋巴細(xì)胞線粒體水平影響下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)作用中的宏觀體現(xiàn)。

由此可見，長(zhǎng)時(shí)間吸食海洛因可造成機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)超負(fù)荷，通過增加自由基的產(chǎn)生，ROS與大分子反應(yīng)以及之后的持續(xù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響其產(chǎn)能效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和（或）細(xì)胞增殖減少，從而通過線粒體途徑對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。

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