周佳麗，顏蘊文，江巧玲，吳 燕，周 青，汪淵

全反式維甲酸及其衍生物對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231凋亡的影響

周佳麗，顏蘊文，江巧玲，吳 燕，周 青，汪淵

目的研究全反式維甲酸（ATRA）及其衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（ATPR）對人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231體外凋亡的影響。方法 不同濃度ATRA及其衍生物ATPR分別處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，Hoechst染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化，RT-PCR檢測凋亡蛋白Caspase-3 mRNA水平的變化，Western blot法檢測相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果與ATRA相比，相同濃度的ATPR能明顯促進MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，隨著濃度的增加，凋亡作用越加顯著（P＜0.05）。RT-PCR顯示ATPR作用后Caspase-3 mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。Western blot法顯示ATPR能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、NF-κB、survivin的表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Grim-19、Caspase-3的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論ATPR比ATRA更明顯地促進人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡。

乳腺癌；MDA-MB-231；ATPR；凋亡

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素A（視黃醇、視黃醛、視黃酸）的活性代謝物［1］，對維持機體正常生長發(fā)育以及生理活動是必不可少的，同時也具有重要的臨床應(yīng)用價值。ATRA現(xiàn)已用于治療各種腫瘤如急性粒細(xì)胞白血病、卡波氏肉瘤、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等，此外還具有抗血管生成和抗炎作用［2］。但是ATRA在治療中也會產(chǎn)生一定的副作用，如皮膚損傷、血脂異常、甲減、頭痛、維甲酸綜合征等［3］。因此研發(fā)高效低毒的維甲酸衍生物已成為當(dāng)今的研究熱點。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethylphenyl ester，ATPR）是本校新合成的維甲酸衍生物，研究［4］已表明ATPR能有效抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和遷移。該研究旨在探究ATPR對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料ATRA購于美國Sigma公司，ATPR由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，均用DMSO配制成40 mmol／L的母液，分裝后避光保存于－20℃冰箱；高糖DMEM購于美國Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst凋亡試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC試劑盒購于美國eBioscience公司；RT-PCR試劑盒購于美國Fermentas公司；引物及內(nèi)參由上海生工生物工程公司合成；鼠抗人Bax、Grim-19、Bcl-2、Caspase-3、β-actin、兔抗人NF-κB、羊抗人survivin均購于美國Santa Cruz公司；其余二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA定量試劑盒和ECL顯色試劑盒均購于美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購于美國ATCC公司，由本實驗室保存。MDA-MB-231用含有10%胎牛血清、100 U／ml鏈霉素、100 μg／ml青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)在37℃含5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度為90%～95%并處于對數(shù)生長期時，用0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.2 Hoechst染色將處于對數(shù)生長期的MDAMB-231接種于含有滅菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度調(diào)整為4×104個／孔，次日用20、40 μmol／L的ATRA和ATPR處理細(xì)胞，并設(shè)細(xì)胞對照組，37℃培養(yǎng)48 h后小心取出蓋玻片于載玻片上，加固定液固定20 min，PBS洗3遍，加入Hoechst染色液染色5 min，再用PBS洗3遍，熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，用20、40 μmol／L ATRA和ATPR處理細(xì)胞，并設(shè)細(xì)胞對照組，處理48 h后常規(guī)消化收集各組細(xì)胞于1.5 ml的EP管中。2 000 r／min離心5 min，預(yù)冷PBS洗3次后100 μl Binding buffer充分吹打重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×105個，取5 μl AnnexinVFITC加入細(xì)胞懸液中，混勻，避光放置15 min后每管加入400 μl Binding buffer和5 μl PI，混勻后流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)CS express軟件分析結(jié)果。

1.2.4RT-PCR檢測 提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增。Caspase-3上游引物：5′-AAATGGACCTGTTGACCTGAA-3′，下游引物：5′-CACAAAGCGACTGGATGAAC-3′，片段大小為272 bp；β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，片段大小為434 bp。PCR擴增條件：Caspase-3為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)35次；β-actin為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后小心取出凝膠于紫外燈下觀察并拍照。

1.2.5Western blot法檢測 將MDA-MB-231均勻接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，次日用20、40 μmol／L ATRA和ATPR處理細(xì)胞，并設(shè)細(xì)胞對照組。處理48 h后PBS洗滌3次，每瓶加入200 μl RIPA蛋白提取液（Tris-HCl，pH＝7.14；150 mmol／L NaCl；1 mmol／L EDTA；1%Triton X-100；0.1%SDS；5 mg／ml Leupeptin；1 mmol／L PMSF），冰上放置30 min，刮取細(xì)胞，移入1.5 ml的預(yù)冷EP管中，反復(fù)凍融3次（－80℃、4℃），超速離心機14 000 r／min離心30 min，將上清液吸入另一個1.5 ml EP管中。BCA法測定總蛋白濃度并將所有樣本調(diào)整成相同濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?2.5%SDS-PAGE，加入等量樣本后電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（β-actin、BCL-2、Bax、NF-κB、Grim-19、survivin，Caspase-3）4℃孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育2 h，洗滌后在暗室內(nèi)加ECL，覆蓋上X線片、顯影、定影。底片掃描后采用Quantity One分析灰度值。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間計量資料使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ATRA和ATPR對細(xì)胞核形態(tài)的影響熒光顯微鏡下，細(xì)胞對照組細(xì)胞核為均一卵圓形，呈均勻藍(lán)色熒光；ATPR處理組細(xì)胞核大小不一、形態(tài)不規(guī)則、固縮、致密濃染、部分碎裂成凋亡小體，折光性變強。隨著濃度的增高，ATPR處理組凋亡小體明顯增多，ATRA處理組也有少許凋亡小體。見圖1。

2.2 ATRA和ATPR對細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞對照組，20、40 μmol／L的ATRA和ATPR處理組的早期凋亡率（第四象限）和晚期凋亡率（第一象限）之和分別為12.29%、14.59%、16.41%、21.54%、25.02%。表明隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢，且ATPR誘導(dǎo)凋亡的作用比ATRA顯著，見圖2。

2.3 ATRA和ATPR對Caspase-3 mRNA水平的影響與細(xì)胞對照組相比，ATPR處理后Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄明顯增加（F＝20.8，P＜0.05）。但ATRA組與細(xì)胞對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

2.4 ATRA和ATPR對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與細(xì)胞對照組比較，ATPR組抗凋亡蛋白Bcl-2、NF-κB、survivin表達(dá)量降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax、Grim-19、Caspase-3表達(dá)量上升（P＜0.05）。ATPR組比ATRA組促凋亡作用更顯著，且ATPR組隨著濃度升高，促凋亡作用增加（FBcl-2＝233.7、FBax＝101.4、FGrim-19＝88.2、FNF-κB＝483.5、Fsurvivin＝414.0、FCaspase-3＝74.1，P＜0.05），見圖4。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年發(fā)病率正在以2%～3%的速度遞增［5］，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。雖然ATRA在治療惡性腫瘤方面發(fā)揮重要作用，但對乳腺癌的治療仍處于臨床前研究階段。研究［6］表明維甲酸與控制乳腺癌細(xì)胞增殖、生存和侵襲行為的細(xì)胞外因子以及細(xì)胞內(nèi)信號通路存在相互作用，但其臨床應(yīng)用效果不盡如人意。ATPR是ATRA的新型衍生物，由本校藥學(xué)院改造合成，較ATRA具有更好的穩(wěn)定性和可溶性。本實驗室歷年研究表明，ATPR可以抑制肺癌、胃癌、結(jié)腸癌以及乳腺癌細(xì)胞在體外的增殖和遷移，且效果優(yōu)于ATRA。

Hoechst染色結(jié)果顯示20 μmol／L的ATPR處理細(xì)胞即可出現(xiàn)明顯的凋亡小體，且隨著濃度升高凋亡小體占總細(xì)胞比例顯著增高，而ATRA組凋亡小體明顯少于ATPR組。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果同樣顯示ATPR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用高于ATRA，與Hoechst染色結(jié)果相符。

細(xì)胞凋亡亦稱細(xì)胞程序性死亡，是一種主動死亡過程，受多種細(xì)胞內(nèi)基因及細(xì)胞外因子調(diào)控。Bcl-2蛋白家族是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其中抗凋亡蛋白有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等，促凋亡蛋白有Bax、Bak、Bok等［7］。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激，Bax／Bak聚合物易位至線粒體膜，能在線粒體上形成孔道，使一些線粒體內(nèi)膜間隙蛋白如細(xì)胞色素C釋放，進而啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。而Bcl-2能封閉Bax形成的孔道，使一些小分子不能自由通透，從而保護細(xì)胞凋亡。Grim-19是Grims家族成員之一，目前認(rèn)為Grim-19的表達(dá)促進細(xì)胞凋亡，其對維持線粒體的跨膜電位至關(guān)重要，而完整的跨膜電位可以保護細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡［9］。NF-κB作為一種核因子，其發(fā)生磷酸化后，能進入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。研究［10－11］證明ATRA能通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)人外周血白血病T細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族中的最小成員，可能主要通過兩條途徑來抑制細(xì)胞凋亡：一是直接抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；二是與細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4結(jié)合，導(dǎo)致CDK2／cyclinE激活和核糖體磷酸化，核糖體磷酸化后啟動細(xì)胞周期，加快G1／S期的轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞凋亡［12］。Caspase家族是半胱氨酸依賴性細(xì)胞死亡蛋白酶。作為凋亡終末效應(yīng)器，Caspase-3可以剪切PARP，其結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞不能進行DNA修復(fù)，從而啟動DNA的降解，引起細(xì)胞凋亡。該實驗Western blot法結(jié)果顯示ATPR處理組Bcl-2表達(dá)量降低而Bax上升，抗凋亡蛋白NF-κB、survivin下降、促凋亡蛋白Grim-19、Caspase-3的表達(dá)上升。而ATRA處理組凋亡蛋白的表達(dá)與ATPR組趨勢相同但不如ATPR顯著。

綜上所述，ATRA與ATPR均能促進乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡。但與ATRA相比，ATPR促進細(xì)胞凋亡的效果更加顯著，其可能通過調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一個極其復(fù)雜且受嚴(yán)格調(diào)控的過程，由多種細(xì)胞因子及信號通路參與調(diào)控，其具體機制有待進一步研究。

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The influence of ATRA and its derivative on the cell apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

Zhou Jiali，Yan Yunwen，Jiang Qiaoling，et al
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，Anhui Medical University；Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the influence of all-trans retinoic acid（ATRA）and its derivative 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl ester（ATPR）on the apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsMDAMB-231 was treated with different concentrations of ATRA and ATPR for 48 h.Hoechst staining and flow cytometry were used to observe cell apoptosis.The mRNA level of apoptosis-related protein Caspase-3 was analyzed by RTPCR.Western blot was performed to detect the expression of apoptosis-related proteins.ResultsCompared with ATRA，the same concentrations of ATPR promoted the apoptosis of MDA-MB-231 more obviously（P＜0.05），and the effect was dose-dependent.RT-PCR showed ATPR significantly raised the mRNA level of Caspase-3（P＜0.05）.Western blot displayed that ATPR decreased the expression of anti-apoptotic protein such as Bcl-2，NF-κB，survivin（P＜0.05）and increased the expression of pro-apoptotic protein Bax，Grim-19，Caspase-3（P＜0.05）.ConclusionContrasted to ATRA，ATPR is able to promote the cell apoptosis of MDA-MB-231 more markedly.

breast cancer；MDA-MB-231；ATPR；apoptosis

R 739.5；R 966；R 34

1000－1492（2015）02－0154－05

2014－10－23接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81272399）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：090413116）

安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室、生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、安徽?。〔抗步ń逃恐匾z傳病基因資源利用重點實驗室，合肥 230032

周佳麗，女，碩士研究生；汪 淵，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydesm-1＠163.com