張吉 臧東鈺

【摘 要】 目的：探討黃芪甲苷（ASIV）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)急性肺損傷（ALI）的保護(hù)作用，并初步探討其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。方法：隨機(jī)將50只SD大鼠分成5組，每組10只。對(duì)照組（靜注生理鹽水1mg/kg），ALI組（靜注LPS，5mg/kg），ASIV組（注射LPS前，給藥3、6、12mg/kg ASIV連續(xù)灌胃7天）。觀察注射12h后肺組織濕干重（W/D）、western blotting檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）的蛋白表達(dá)。結(jié)果：ALI組W/D值較對(duì)照組上升（P<0.01），GRP78、ChOP蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高（P<0.01）;ASIV組W/D值較ALI組下降（P<0.01），GRP78、ChOP蛋白表達(dá)較ALI組降低（P<0.01），并呈一定的劑量依賴性。結(jié)論：黃芪甲苷對(duì)急性肺損傷大鼠有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 黃芪甲苷; 急性肺損傷; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激; 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）;C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2014）15-0019-02

Effect of Astragaloside IV on endoplasmic reticulum stress in a rat model of acute lung injury

ZHANG Ji，ZANG Dong-yu

（Department of Thoracic Surgery， Affiliated Third Hospital， Liao ning medical college， Jin zhou 121000， China）

Abstract：Objective To explore the effect of Astragaloside IV on apoptosis mediated by endouplasmic reticulum stress （ERS） in a rat model of acute lung injury （ALI） induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods Fifty SD rats were randomly divided into control group， ALI group， and ASIV group， 10 in each group. The rats in the control group were treated with normal saline. The rats in the ALI group were treated with LPS （5mg/kg）. The rats in the ASIV groups were pretreated with ASIV （3， 6， 12mg/kg） for 7days. After 12h injection， the change of wet-dry weight （W/D） were determined. The expressions of glucose-regulated protein 78 （GRP78） and C/EBP homologous protein （CHOP） were determined by Western blot. Results Compar2ed with the control group， the W/D was increased （P﹤0.01）， the expression of GRP78 and CHOP were increased in the ALI group （P﹤0.01）. Compared with ALI group， the W/D was decreased （P﹤0.01）， the expression of GRP78 and CHOP were decreased in the ASIV groups （P﹤0.01）. Conclusion Astragaloside IV has a protective effect on LPS-induced acute lung injury， which is partially via endouplasmic reticulum stress.

Keywords：Astragaloside IV; acute lung injury; endouplasmic reticulum stress; glucose-regulated protein 78 （GRP78）; C/EBP homologous protein （CHOP）

嚴(yán)重的創(chuàng)傷、外傷及大手術(shù)易并發(fā)有革蘭陰性菌感染所產(chǎn)生的內(nèi)毒素血癥，肺部是最易受累的器官，容易引發(fā)急性肺損傷（actue lung injury，ALI），進(jìn)一步發(fā)展可致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分脂多糖（LPS）具有明顯的致ALI作用。已證實(shí)在LPS引起肺的急性炎癥反應(yīng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是內(nèi)毒素源性的急性肺損傷的重要病理生理機(jī)制[2]。中藥黃芪（astragalus，As） 為豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，味甘、性溫、乃補(bǔ)氣之圣藥。黃芪甲苷（Astragaloside IV，ASIV）為黃芪的有效成分之一，對(duì)ALI具有治療作用[3]，但治療ALI的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)觀察ASIV干預(yù)對(duì)ALI大鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，進(jìn)一步明確黃芪甲苷對(duì)ALI的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 50只SD大鼠250～300g，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑有黃芪甲苷（上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)高效液相色譜法鑒定純度為98%，批號(hào)：CM0308QA13），內(nèi)毒素LPS（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：L2880），組織蛋白提取試劑盒（南京碧云天公司，批號(hào)：P0013B），葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78 ，批號(hào)：ab21685）、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP，批號(hào)：ab11419）和β-actin（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-47778），其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 50只健康SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。對(duì)照組（靜注生理鹽水1mg/kg），ALI組（靜注LPS，5mg/kg），ASIV高、中、低劑量組（注射LPS前，給藥3、6、12mg/kg ASIV連續(xù)灌胃7d）。各組動(dòng)物取樣前禁食12h，20%烏拉坦（12g/kg）腹腔注射麻醉。開(kāi)胸取右前葉組織做濕干重（W/D）測(cè)定;取右肺副葉、后葉置于生理鹽水中迅速漂洗干凈后，立即放入液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存，用作western blotting檢測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 肺組織作濕干重（W/D）測(cè)定 取右前葉組織測(cè)定濕重量（wet weight，W）后，至干燥箱（80℃，24h）烤至恒重，測(cè)干質(zhì)量（dry weight，D），計(jì)算肺濕干重比值。以W/D表示肺組織含水量。

1.3.2 western blotting法測(cè)定GRP78、CHOP蛋白表達(dá) -80℃冰箱取出凍存的肺組織標(biāo)本100mg加入200ml裂解液中剪碎后移入1.5ml EP管中，4℃超聲粉碎，12000r/min離心30min，取上清液用于蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，恒壓電泳95V，室溫1h，4℃封閉過(guò)夜。將膜放入Ⅰ抗（1∶500稀釋），雜交2h，封閉漂洗后將膜放入加入堿性磷酸酶標(biāo)記的Ⅱ抗中（二抗均1∶500稀釋），室溫孵育1～2 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5min，條帶出現(xiàn)，終止反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行半定量灰度分析，以灰度比值表示蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P <0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)肺組織W/D比值的影響 ALI組肺W/D顯著高于對(duì)照組（P﹤0.01），ASIV組肺W/D較ALI組顯著降低（P﹤0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 黃芪甲苷對(duì)大鼠肺組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組比較，ALI組大鼠GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均升高（P<0.01）;與ALI組比較，ASIV組大鼠GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均降低（P <0.05， P<0.01） ，且呈一定的劑量依賴性。（表2，圖1）

3 討論

急性肺損傷發(fā)病急而嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率都較高，盡管對(duì)其機(jī)制和治療研究較多，但無(wú)有效手段治療，亦無(wú)特效藥。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，能夠?qū)C(jī)體造成廣泛的損害和影響。當(dāng)病灶或血液中革蘭氏陰性病原菌大量死亡，釋放出來(lái)的大量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入血液時(shí)，能夠激活多種細(xì)胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等引起全身炎癥反應(yīng)，引起內(nèi)毒素血癥。感染、創(chuàng)傷等急性打擊及伴隨的失血、低氧、缺血再灌注損傷等多種ALI誘發(fā)因素引起組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能狀態(tài)的改變產(chǎn)生ERS的活化因素[1，2，4]。適量的ERS可保護(hù)細(xì)胞，但過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GRP78是ERS的經(jīng)典標(biāo)志。在健康大鼠體內(nèi)，沒(méi)有或者偶見(jiàn)GRP78蛋白大量表達(dá)并啟動(dòng)ERS;持續(xù)過(guò)量的ERS可激活CHOP，并大量表達(dá)，最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[5]。

中藥黃芪為一味傳統(tǒng)的補(bǔ)氣藥，含多種生物活性物質(zhì)，大量臨床和動(dòng)物研究證實(shí)，黃芪對(duì)肺部疾病有良好的治療作用。黃芪甲苷是黃芪中主要活性成分，研究表明黃芪甲苷對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用[3]。本研究結(jié)果顯示，ALI組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量增多，經(jīng)ASIV干預(yù)后GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量降低，提示黃芪甲苷可能通過(guò)抑制GRP78和CHOP蛋白表達(dá)，改善急性肺損傷狀態(tài)。

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（收稿日期：2014.06.24）