李然紅，董世鵬，陳 鑫，安文和

［1.植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱師范大學(xué)），黑龍江 哈爾濱 150025；2.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012］

狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白基因生物信息學(xué)分析

李然紅1，2，董世鵬2，陳 鑫2，安文和2

［1.植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱師范大學(xué)），黑龍江 哈爾濱 150025；2.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012］

通過NCBI查找到狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白基因序列，利用生物信息學(xué)方法對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、二維結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn)、所屬蛋白家族、代謝途徑、進(jìn)化地位等信息進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，不含N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，屬于EF-hand蛋白家族，在鈣信號、cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物與病原菌的相互作用、細(xì)胞減數(shù)分裂等過程中均有重要作用。

狗棗獼猴桃；鈣調(diào)節(jié)蛋白；生物信息學(xué)；蛋白家族；代謝途徑

狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta），別名狗棗子，屬獼猴桃科獼猴桃屬藤本植物，是最為耐寒的獼猴桃種類之一［1］，其果實(shí)酸甜可口、柔軟多汁，富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)［2～3］，具有強(qiáng)壯、解熱及收斂、調(diào)節(jié)人體血液中pH、使血液保持鮮紅，增加其輸送氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)等多種醫(yī)療保健功能［4～5］，以及降血脂、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等醫(yī)藥功能［6～8］。狗棗獼猴桃雄株葉片上半部分常變成白色或者粉色，直至紫紅色，也是非常好的觀葉樹種。鈣調(diào)節(jié)蛋白是一種能與鈣離子結(jié)合從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝途徑的蛋白質(zhì)，在真核生物細(xì)胞中起到至關(guān)重要的作用［9］。該研究通過生物信息學(xué)的方法，對狗棗獼猴桃鈣調(diào)蛋白基因及蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、三維結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn)、所屬蛋白家族、代謝途徑等信息進(jìn)行了預(yù)測，以期為其生物學(xué)特性的研究及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

通過NCBI在線搜索，查找到狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白基因及其編碼序列（GenBank：EF441489.1），用BlastP進(jìn)行同源性搜索，理化性質(zhì)用ProtParam進(jìn)行分析，三維結(jié)構(gòu)用Geno3D進(jìn)行預(yù)測，用Net-NGlyc對N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，NetOGlyc對O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，Pfam進(jìn)行蛋白家族預(yù)測，KEGG進(jìn)行代謝途徑預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)預(yù)測

通過ProtParam對狗棗獼猴桃鈣調(diào)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白由148個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量16699.4 D，等電點(diǎn)為4.10，富含天冬氨酸和谷氨酸。該蛋白共有4個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)鈣離子需要4個(gè)氨基酸來結(jié)合，如封三圖1所示。

2.2 多序列比對

通過BlastP對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明，該蛋白與葛棗獼猴桃、美麗獼猴桃、擬南芥、胡蘿卜、玉米、甜橙等多種植物的蛋白序列有相似性。選取其中部分序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)節(jié)蛋白在不同生物細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)保守性很強(qiáng)，有人推測若該蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生突變很可能被致死，因而在整個(gè)進(jìn)化過程中都始終保持結(jié)構(gòu)的保守性［10］。

選取的序列如下：狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABR21730.1），海棗鈣調(diào)節(jié)蛋白（XP_008810798.1），谷子鈣調(diào)節(jié)蛋白（XP_004961666.1），擬南芥z-box結(jié)合因子（CAM12360.1），葛棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABR21756.1，ABR21757.1），美麗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABR21718.1），綠豆鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABG82015.1），甜菊鈣調(diào)節(jié)蛋白（AAL79908.1），野生大豆鈣調(diào)節(jié)蛋白（KHN34595.1），甘薯鈣調(diào)節(jié)蛋白（ACG63497.1），玉米鈣調(diào)節(jié)蛋白（NP_001105490.1，NP_001167662.1），菠菜鈣調(diào)節(jié)蛋白（P04353.2），胡蘿卜鈣調(diào)節(jié)蛋白（AAQ63461.1，AAT73619.1），北美云杉鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABK22713.1）， 甜 橙 鈣 調(diào) 節(jié) 蛋 白（XP_006470430.1）。其中，狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白與海棗鈣調(diào)節(jié)蛋白（XP_008810798.1）的同源性最高（封三圖2）。

將選取的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白（ABR21730.1）與海棗鈣調(diào)節(jié)蛋白（XP_008810798.1）的親緣關(guān)系最近，而與甜橙鈣調(diào)節(jié)蛋白（XP_006470430.1）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3）。

2.3 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用ExPASy的SOPMA軟件在線對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如封三圖4所示。組成狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白的148個(gè)氨基酸中，其中90個(gè)氨基酸可能會形成α螺旋，38個(gè)可能形成無規(guī)則卷曲，13個(gè)可能形成β-轉(zhuǎn)角，7個(gè)可能形成延伸連。

2.4 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

用Geno3D對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如封三圖5所示。該蛋白含有2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)α螺旋及其中間的一個(gè)短的非螺旋結(jié)構(gòu)連接，為鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 糖基化位點(diǎn)預(yù)測

通過NetNGlyc1.0 server對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白內(nèi)有2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但是由于該蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用，不含有信號肽序列，因此很有可能不含N-糖基化位點(diǎn)。采用NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測分?jǐn)?shù)均小于0.5，故推測該蛋白內(nèi)不含O-糖基化位點(diǎn)。

圖3 狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白相似性序列進(jìn)化樹

圖7 狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白參與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

2.6 所屬蛋白家族預(yù)測

通過Pfam對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白所屬蛋白家族進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白含有EF-hand結(jié)構(gòu)域，屬于EF-hand 7蛋白亞家族。EF-hand具有helix-loop-helix結(jié)構(gòu)域，是鈣結(jié)合蛋白這個(gè)大家族中的一員，EF-hand結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)helix-loop-helix的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，就像人手的大拇指和食指，在這個(gè)結(jié)構(gòu)當(dāng)中，Ca2+由配體協(xié)調(diào)連接在環(huán)中。EF-hand包含2個(gè)α螺旋，2個(gè)α螺旋由一個(gè)較短的環(huán)連接，這個(gè)環(huán)通常由12個(gè)氨基酸組成，通常是連接鈣離子的位點(diǎn)（封三圖6）。

2.7 代謝途徑分析

用KEGG對狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白代謝途徑進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白參與Rap1、鈣信號、cGMP-PKG、cAMP、磷脂酰肌醇等信號途徑（圖7）。最重要的是其通過直接或間接調(diào)節(jié)胞內(nèi)各種代謝調(diào)節(jié)劑如激素、第二信使（鈣離子和cAMP）代謝，進(jìn)而對至少15種重要代謝相關(guān)的酶起調(diào)節(jié)作用，間接參與細(xì)胞的代謝活動。

3 結(jié)論

狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白屬于EF-hand 7蛋白家族，由148個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量16 699.4 D，富含天冬氨酸和谷氨酸，這2種氨基酸屬于酸性氨基酸，因而使該蛋白等電點(diǎn)呈偏酸性，為4.10。其序列具有高度保守性，多序列比對結(jié)果表明其與海棗鈣調(diào)節(jié)蛋白同源性最高。狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白不含N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，這可能與其不是分泌型蛋白有關(guān)；狗棗獼猴桃鈣調(diào)節(jié)蛋白是鈣離子信號應(yīng)答的關(guān)鍵蛋白，并且參與Rap1、鈣信號、cGMP-PKG、cAMP、磷脂酰肌醇等信號途徑。

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（本文責(zé)編：金 蘋）

Bioinformatics Analysis of Calmodulin gene in Actinidia kolomikta

LI Ran-hong1，2，DONG Shi-peng2，CHEN Xin2，AN Wen-he2
（1.Key Laboratory of Plant Biology，College of Heilongjiang Province，Harbin Normal University，Harbin Heilongjiang 150025，China；2.College of Life Sciences and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang Heilongjiang 157012，China）

The Calmodulin gene of Actinidia kolomikta was found through Genebank of NCBI.And the physical and chemical properties，two-dimensional structure，three-dimensional structure，glycosylation sites，protein family，metabolic pathways and other informations of the Calmodulin in Actinidia kolomikta were predicted by bioinformatics methods.The results showed that the protein is rich in glutamic acid and aspartic acid，does not contain N-glycosylation sites and O-glycosylation sites，belongs to the EF-hand protein family，which plays an important role in the calcium signal and cAMP signal transduction，meiosis and pathogen interaction.

Actinidia kolomikta；Calmodulin；Bioinformatics；Protein family；Metabolic pathways

S663.4；Q51

A

1001-1463（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.02.001

2015-01-15

哈爾濱師范大學(xué)“植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”開放項(xiàng)目（ZK201208）；植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（哈爾濱師范大學(xué)）開放基金

李然紅（1981—），女，黑龍江牡丹江人，碩士，講師，主要從事遺傳學(xué)、基因工程研究。聯(lián)系電話：（0）13904830428。E-mail：swxlrh@126.com