石紀奎， 李永富， 史 鋒*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

機械活化釀酒酵母葡聚糖改善其水溶性

石紀奎1， 李永富2， 史 鋒1*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

釀酒酵母葡聚糖是一種良好的免疫效應應答劑，但是不溶于水，這嚴重影響了它在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中的應用。對釀酒酵母葡聚糖進行機械改性，顯著提高了它的溶解性。隨著機械強度和活化時間的增加，葡聚糖的溶解率從11%提高到37%?；罨蟮钠暇厶堑牧矫黠@變小，比表面積增大；微觀形態(tài)結(jié)構規(guī)整性降低，表面呈現(xiàn)粗糙狀。紅外光譜分析證實，活化之后葡聚糖的主體化學結(jié)構沒有改變，但羥基吸收峰位置向低頻方向發(fā)生較大偏移，氫鍵鍵能降低，氫鍵相互作用減弱。這些變化有利于葡聚糖分子與水分子相互作用，提高酵母葡聚糖的溶解性。由此制備的水溶性葡聚糖具有良好的免疫活性，可以顯著刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、NO，它們的分泌量分別是陰性對照組的29.3、28.3、5.6倍。因此機械活化是一種提高釀酒酵母葡聚糖溶解性的高效、簡便、環(huán)保方法。

釀酒酵母葡聚糖；機械活化；水溶性

釀酒酵母是啤酒行業(yè)的主要微生物，每年因釀酒會產(chǎn)生大量的廢棄釀酒酵母。釀酒酵母細胞壁含有豐富的多糖，其中40%-60%是β-D-葡聚糖[1]。研究表明，釀酒酵母葡聚糖是一種良好的生物效應應答劑，具有增強免疫力、激活免疫細胞、抗腫瘤、抗感染、抗氧化等功能[2]。但是釀酒酵母葡聚糖通過分子間氫鍵相互作用，形成致密的螺旋結(jié)構，致使葡聚糖分子難以溶于水，這嚴重影響了釀酒酵母葡聚糖在食品、保健品、醫(yī)藥等領域上的應用[3]。為了提高釀酒酵母葡聚糖的水溶性，國內(nèi)外學者對其進行了修飾和改性研究，主要方法包括化學方法和物理方法?；瘜W修飾方法主要是通過在葡聚糖分子上引入親水性基團而增加其水溶性，主要的修飾方法有硫酸化、羧甲基化、磷酸化修飾[4]。但是這類修飾通常在有機相體系以及強酸、強堿中進行，不僅成本高、污染嚴重，而且葡聚糖的損失嚴重。物理方法主要是通過超聲波解聚，來降低葡聚糖的相對分子質(zhì)量，從而增加其水溶性，但是超聲解聚只能降低葡聚糖的相對分子質(zhì)量到一個極限恒定值，促進葡聚糖溶解的效果不佳[5]。因此急需一種環(huán)保、簡單、高效的方法促進釀酒酵母葡聚糖的水溶性。

機械活化主要通過機械力的摩擦、剪切、沖擊等作用，使固體顆粒物質(zhì)的結(jié)構及物化性能發(fā)生改變，將部分機械能轉(zhuǎn)化為物質(zhì)內(nèi)能，從而增加固體顆粒物質(zhì)的化學活性。許多研究表明，機械活化可以顯著改變多糖的結(jié)晶結(jié)構、相對分子質(zhì)量分布、分子鏈排列，從而提高多糖的化學反應和酶解反應活性[6-8]。通過機械活化對多糖進行改性，具有簡單、方便、無污染、成本低的優(yōu)點。作者利用一種行星球磨機活化釀酒酵母葡聚糖，以葡聚糖在水中的溶解率為評價指標，考察了機械力強度和作用時間對葡聚糖水溶性的影響。利用粒度分析儀、掃描電子顯微鏡和紅外光譜分析儀表征了機械活化前后釀酒酵母葡聚糖微觀形態(tài)和化學結(jié)構的變化，探討機械活化提高葡聚糖水溶性的原因。最后分析了水溶性的釀酒酵母葡聚糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和NO的刺激作用，了解其免疫性能。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

釀酒酵母葡聚糖：上海杰康諾生物技術有限公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7：浙江大學生命科學學院；脂多糖（LPS）：美國Sigma公司；葡萄糖、蒽酮、溴化鉀、亞硝酸鈉、磺胺、N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽：國藥集團化學試劑有限公司，分析純。TNF-α、IL-6檢測試劑盒：美國eBioscience公司；DMEM完全培養(yǎng)基、0.25%胰酶：美國Gbico公司；胎牛血清（FBS）：浙江杭州四季青生物工程材料有限公司。

XXM行星球磨機：浙江嘉興中俄科技轉(zhuǎn)化中心；L-535R離心機：湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；Freezone冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；S3500激光粒度分析儀：美國 Microtrac公司；NEXUS傅里葉紅外光譜分析儀：美國Nicolet公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡：荷蘭FEI公司；Series 8000WJ二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司；ELX800酶標儀：美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母葡聚糖的機械活化處理將15 g釀酒酵母葡聚糖與150 g直徑為3 mm的磨球混勻后，一起放入行星球磨罐內(nèi)。調(diào)節(jié)電機轉(zhuǎn)速和運轉(zhuǎn)時間，得到不同的釀酒酵母葡聚糖處理樣品。用30目不銹鋼篩將磨球和葡聚糖分離，活化的葡聚糖密封保存，及時分析。

1.2.2溶解率的測定及水溶性釀酒酵母葡聚糖的制備取0.5 g活化的釀酒酵母葡聚糖樣品，加入20 mL去離子水，攪拌30 min促進溶解，之后4 000 r/min離心20 min。收集上清液定容至25 mL，利用蒽酮法測定上清液中總糖的含量。

將上述釀酒酵母葡聚糖的上清液經(jīng)冷凍干燥得到固體水溶性釀酒酵母葡聚糖樣品。

1.2.3 粒度分布分析利用S3500激光粒度分析儀測定活化前后釀酒酵母葡聚糖的粒度分布。

1.2.4 紅外光譜分析將樣品與KBr按1∶50的比例混合研磨制成薄片，利用NEXUS傅里葉紅外光譜分析儀進行掃描測試，范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 掃描電鏡分析利用Quanta 200掃描電子顯微鏡分析活化前后釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)。

1.2.6 水溶性釀酒酵母葡聚糖的免疫活性分析取小鼠巨噬細胞系RAW264.7，用DMEM完全培養(yǎng)液 （添加10%FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h之后用0.25%胰酶消化細胞，離心后收集細胞計數(shù)備用。

調(diào)整細胞濃度至5×105個/mL，接種于96孔板中，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)12 h，加入水溶性釀酒酵母葡聚糖，至終質(zhì)量濃度分別為50、100、500 μg/mL，以10、100、1 000 ng/mL LPS為陽性對照，以培養(yǎng)基為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后取上清液，利用ELISA檢測試劑盒測定其中的細胞因子TNF-α、IL-6含量；繼續(xù)培養(yǎng)48 h之后取上清液，按照文獻[9]測定NO含量。使用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，同時檢驗實驗組和對照組之間的差異性，*P＜0.05表示顯著差異，**P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母葡聚糖的溶解率

通過調(diào)節(jié)行星球磨機的電機轉(zhuǎn)速，改變機械力的輸出強度，考察了球磨機轉(zhuǎn)速和作用時間對活化的釀酒酵母葡聚糖在水中溶解率的影響，結(jié)果見圖1。

當行星球磨機的轉(zhuǎn)速在837 r/min時，隨著球磨時間由0 min增加到20 min，葡聚糖的溶解率從11%逐漸增加到30%。同時當轉(zhuǎn)速調(diào)整為1 116 r/min時，葡聚糖的溶解率從11%增加到37%?？紤]到實驗操作的安全性以及樣品的損失率，最終將轉(zhuǎn)速確定為1 116 r/min，時間定為20 min，以此對釀酒酵母葡聚糖進行機械活化，以制備水溶性的葡聚糖。由此可知，在強烈的摩擦、剪切、擠壓、沖擊等機械力的作用下，釀酒酵母葡聚糖的溶解率顯著增加。為了了解機械活化提高釀酒酵母葡聚糖水溶性的原因，對活化前后的葡聚糖進行粒度分布分析、微觀形態(tài)結(jié)構分析和化學結(jié)構分析。

圖1 不同活化條件下釀酒酵母葡聚糖的溶解率Fig.1 Water-solubility of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan after mechanical activation

2.2 釀酒酵母葡聚糖的粒度分布

釀酒酵母葡聚糖機械活化前后的粒度分布見圖2。未經(jīng)過活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒粒度集中在40～100 μm，并且分布狹窄（圖2a）。經(jīng)過1 116 r/min機械活化20 min之后，釀酒酵母葡聚糖的粒度明顯變小，集中在0.5～10 μm（圖2b）。這說明釀酒酵母葡聚糖顆粒在機械活化過程中，受到了剪切力、擠壓力、摩擦力、沖擊力等機械力的作用，強烈的機械力作用破壞了葡聚糖分子的致密結(jié)構，致使葡聚糖顆粒的粒度變小。而葡聚糖顆粒粒度的降低和比表面積增加，有利于水分子與葡聚糖分子相互作用，增加活化之后葡聚糖的水溶性。

圖2 機械活化前后釀酒酵母葡聚糖粒度分布Fig.2 Particle size distribution of Saccharomyces cerevisiae β -D-glucan before and after mechanical activation

2.3 釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)

采用掃描電子顯微鏡分析活化前后釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)，結(jié)果見圖3。表明經(jīng)過機械活化之后的釀酒酵母葡聚糖顆粒微觀形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。未經(jīng)活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒呈現(xiàn)出干癟的小球狀，顆粒的表面比較光滑，經(jīng)過機械活化之后的酵母葡聚糖顆粒顯著變小，顆粒變得雜亂無章，表面變得粗糙，呈現(xiàn)無規(guī)則狀。說明機械活化可以破壞酵母葡聚糖的高級結(jié)構，增大比表面積，從而有利于水分子與酵母葡聚糖相互作用，增強釀酒酵母葡聚糖的水溶性。

圖3 機械活化前后釀酒酵母葡聚糖的掃描電鏡圖Fig.3 SEM of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan before and after mechanical activation

2.4 釀酒酵母葡聚糖紅外光譜

紅外光譜分析方法是多糖研究中檢測化學結(jié)構常用的方法。圖4是活化前后釀酒酵母葡聚糖的紅外光譜圖。3 430 cm-1是多糖的-OH吸收峰，2 923 cm-1和1 422 cm-1是多糖中C—H鍵的吸收峰。比較活化前后葡聚糖紅外圖譜，沒有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，說明活化過程中釀酒酵母葡聚糖始終保持原有的基本化學結(jié)構。但羥基吸收峰的位置向低波長移動，根據(jù)公式ΔE=hc（v1-v2）（其中ΔE為氫鍵能量變化，h為普朗克常數(shù)，c為光速，v1、v2分別為機械活化前后羥基的伸縮振動峰波數(shù)）可計算出與羥基相關的氫鍵平均鍵能變化[10]。在1 116 r/min活化20 min后，釀酒酵母葡聚糖羥基氫鍵能量降低了5.52×10-3eV，表明經(jīng)過機械活化處理降低了氫鍵鍵能，減弱葡聚糖分子氫鍵的相互作用，有利于水分子進入到葡聚糖顆粒內(nèi)部，從而提高葡聚糖的水溶性。

圖4 機械活化前后釀酒酵母葡聚糖的紅外光譜圖Fig.4 FTIR of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan before and after mechanical activation

2.5 水溶性釀酒酵母葡聚糖的免疫活性

巨噬細胞在人的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。巨噬細胞可以分泌TNF-α、IL-6、NO等來介導、調(diào)節(jié)免疫反應和炎癥反應。因此作者利用巨噬細胞RAW 264.7探討機械活化后形成的水溶性釀酒酵母葡聚糖（SG）對巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、NO量的變化。水溶性釀酒酵母葡聚糖是將釀酒酵母葡聚糖經(jīng)過1 116 r/min機械活化20 min之后，離心取上清液，最后經(jīng)冷凍干燥制備而得。

2.5.1 水溶性葡聚糖對巨噬細胞分泌NO的刺激作用圖5顯示了在水溶性葡聚糖刺激24 h之后，巨噬細胞RAW 264.7產(chǎn)生的NO含量。隨著葡聚糖質(zhì)量濃度的提高，NO含量隨之增加，呈現(xiàn)濃度依懶性。當G40-20質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，產(chǎn)生的NO濃度達到36.5 μmol/mL，而陰性對照組僅為6.5 μmol/mL。實驗組與對照組相比表現(xiàn)出極顯著的差異，說明水溶性葡聚糖可以極顯著的刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO。

圖5 巨噬細胞分泌的NO濃度Fig.5 Amount of NO secreted by macrophage

2.5.2 水溶性葡聚糖對巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6的刺激作用利用ELISA檢測試劑盒測定了經(jīng)水溶性葡聚糖刺激后巨噬細胞分泌的細胞因子含量，結(jié)果見圖6-7。經(jīng)水溶性葡聚糖刺激24 h之后，巨噬細胞RAW 264.7分泌細胞因子TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度極顯著提高。水溶性葡聚糖在低質(zhì)量濃度下已經(jīng)呈現(xiàn)出良好的刺激作用，質(zhì)量濃度越高刺激作用越明顯。當SG質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6的量分別達到142.22 ng/mL和1.70 ng/mL，而陰性對照組僅為4.85 ng/mL和0.06 ng/mL。這說明水溶性的葡聚糖可以極顯著性的刺激巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6。

3 結(jié)語

釀酒酵母葡聚糖是釀酒酵母細胞壁重要的組成成分，具有良好的免疫應答調(diào)節(jié)作用，但由于其特殊的化學結(jié)構而不溶于水。作者在固相狀態(tài)下利用一種行星球磨機活化釀酒酵母葡聚糖，以提高其溶解性。經(jīng)過機械活化之后釀酒酵母葡聚糖在水中的溶解率明顯提高，最高達到37%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒粒度顯著降低；利用掃描電鏡觀察顆粒的微觀形態(tài)結(jié)構的變化，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母葡聚糖顆粒在機械力的作用下，微觀形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，顆粒細化，表面粗糙不規(guī)整。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)活化的酵母葡聚糖的基本化學結(jié)構沒有發(fā)生變化，但是氫鍵鍵能降低，葡聚糖氫鍵相互作用減弱。表明經(jīng)過機械活化之后，釀酒酵母葡聚糖的結(jié)構發(fā)生了明顯的變化，致密的螺旋結(jié)構受到一定的破壞，這些結(jié)構的變化有助于葡聚糖分子與水分子進一步相互作用，增加釀酒酵母葡聚糖的溶解性。通過檢測小鼠巨噬細胞RAW 264.7受水溶性葡聚糖刺激之后產(chǎn)生TNF-α、IL-6以及NO的質(zhì)量濃度變化，表明水溶性釀酒酵母葡聚糖可以極顯著地刺激巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-6以及NO，這說明通過機械活化制備的水溶性葡聚糖具有良好的免疫活性。因此機械活化是一種簡單、高效、綠色環(huán)保的釀酒酵母葡聚糖的改性方法。

圖6 巨噬細胞分泌TNF-α的質(zhì)量濃度Fig.6 Amount of TNF-α secreted by macrophage

圖7 巨噬細胞產(chǎn)生IL-6的質(zhì)量濃度Fig.7 Amount of IL-6 secreted by macrophage

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Improve Water-Solubility of β-D-Glucan from Saccharomyces cerevisiae by Mechanical Activation

SHI Jikui1， LI Yongfu2， SHI Feng1*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermention Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The β-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae is a potent biological response modifier. But it is insoluble in water.This is the major obstacle for its application in the food and medical fields.In order to improve the water-solubility of β-D-glucan from S.cerevisiae，mechanical activation was performed here in the solid state by using a planetary ball miller.The water-solubility of β-D-glucan increased sharply from 11%to 37%，as the mechanical force and activation time increased.After mechanical activation，the particle size of β-D-glucan decreased obviously and its morphological structure became to be irregular and rough.The basic chemical structure of β-D-glucan was not destroyed based on FTIR analysis，but the energy of hydrogen bond decreased.These changes would be benefit for β-D-glucan to interact with water molecule and therefore to increase its solubility.Most importantly，the soluble β-D-glucan prepared by this method could significantly stimulate the macrophage cells to secrete TNF-α，IL-6 and NO.Their concentrations were 29.3-，28.3-and 5.6-folds that of the controls，respectively.These results indicate that mechanical activation is a simple，environmentally friendly and efficient method to improve water-solubility of β-D-glucan.

β-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae，mechanical activation，water-solubility

TS 261.9

A

1673—1689（2015）05—0536—06

2014-02-11

江蘇省科技支撐計劃項目（BE2012428）。

*通信作者：史 峰（1970—），女，新疆烏魯木齊人，工學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物代謝工程方面的研究。

E-mail：shifeng@jiangnan.edu.cn