王燚霈 朱 瑩王 璇

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

·研究報(bào)告·

潰瘍性結(jié)腸炎（脾腎陽(yáng)虛證）大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究*

王燚霈 朱 瑩△王 璇

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

目的研制與臨床證候相吻合的切實(shí)可行的潰瘍性結(jié)腸炎（脾腎陽(yáng)虛證）的大鼠模型。方法將SD實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、脾腎陽(yáng)虛組、潰瘍性結(jié)腸炎組（潰結(jié)組）、脾腎陽(yáng)虛潰結(jié)組（病證結(jié)合組），正常對(duì)照組無(wú)任何干預(yù)措施；脾腎陽(yáng)虛組先以番瀉葉灌胃，然后用冰水濕潤(rùn)皮毛后再用電風(fēng)扇將其皮毛吹干；潰結(jié)組以三硝基苯磺酸鈉（TNBS）灌腸；病證結(jié)合組先以脾腎陽(yáng)虛組的方法處理，連續(xù)處理4周后，再予TNBS灌腸。觀察大鼠一般癥狀體征、中醫(yī)證候、結(jié)腸組織的改變、血清大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、大鼠游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等指標(biāo)。結(jié)果病證結(jié)合組、脾腎陽(yáng)虛組大鼠的中醫(yī)證候評(píng)分、血清FT3、FT4、SOD、MDA等指標(biāo)與正常對(duì)照組、潰結(jié)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；病證結(jié)合組、潰結(jié)組結(jié)腸肉眼觀及結(jié)腸黏膜損傷程度與正常對(duì)照組、脾腎陽(yáng)虛組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論先以番瀉葉灌胃及冰水濕身風(fēng)干法處理大鼠，再用TNBS灌腸，從而研制出的潰瘍性結(jié)腸炎（脾腎陽(yáng)虛證）大鼠模型，對(duì)臨床有實(shí)踐意義。

潰瘍性結(jié)腸炎 脾腎陽(yáng)虛證 病證結(jié)合 動(dòng)物模型 大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的病因尚不十分清楚，在我國(guó)發(fā)病率逐年增高［1］。為了更好地闡明該病的病因病機(jī)、發(fā)展規(guī)律及理想的防治，建立理想的動(dòng)物模型具有重要的意義。筆者在近10年的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，大多UC患者臨床表現(xiàn)以脾腎陽(yáng)虛的癥狀為主，目前臨床上對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的研究多種多樣，但未見(jiàn)有契合脾腎陽(yáng)虛證的動(dòng)物模型。為此，本研究前期進(jìn)行了脾腎陽(yáng)虛證潰結(jié)大鼠的研制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌雄各半SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 試劑與儀器 大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、大鼠游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）測(cè)定試劑盒，購(gòu)于上海通蔚生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京博邁斯科技發(fā)展有限公司。全自動(dòng)圖像數(shù)字化分析儀、微循環(huán)顯微鏡（上海徠卡顯微鏡公司生產(chǎn)，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科及皮膚病研究實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.3 動(dòng)物分組 選用健康成年SD雌雄各半大白鼠40只，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、脾腎陽(yáng)虛組、潰瘍性結(jié)腸炎組（潰結(jié)組）、脾腎陽(yáng)虛潰結(jié)組（病證結(jié)合組），每組各10只。

1.4 模型制備 正常對(duì)照組無(wú)任何干預(yù)措施。潰結(jié)組：參照文獻(xiàn)［2-3］，使用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)法：將大鼠禁食12 h，10%水合氯醛以4 mL/kg進(jìn)行腹腔注射，后將一長(zhǎng)約12 cm直徑2 mm的橡膠輸液管用石蠟油潤(rùn)滑后緩慢插入肛門(mén)深約8 cm，將0.5 mL的三硝基苯磺酸乙醇溶液以100 mg/kg的比例注入肛管，造成潰結(jié)模型，3周后采集標(biāo)本觀察。脾腎陽(yáng)虛組參考文獻(xiàn)［4-5］，用自制的濃度為100%的番瀉葉藥液給大鼠灌胃，每日1次，每只3 mL，30 min后向每只大鼠均勻噴灑60 mL 3℃的冰水，將全身皮毛打濕，然后再把大鼠置于1400r/min的電風(fēng)扇前將其毛發(fā)吹干，連續(xù)處理4周。癥證結(jié)合組綜合潰結(jié)組和脾腎陽(yáng)虛組的方法，即先以100%番瀉葉灌胃，冰水噴濕全身皮毛后再用電風(fēng)扇吹干，連續(xù)處理4周后，再予TNBS灌腸，3周后采集標(biāo)本觀察。

1.5 標(biāo)本采集與處理 1）于造模后稱大鼠體質(zhì)量，脫頸椎全部處死，自距肛門(mén)約2 cm處向上剖取結(jié)腸8 cm左右，將取出結(jié)腸組織剖開(kāi)、展平，肉眼觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)，并做組織損傷評(píng)分比較。2）用10%烏拉坦將大鼠麻醉，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分離大鼠頸動(dòng)脈，插管并結(jié)扎，松開(kāi)血管夾，采集管采集血液，將采集管放入離心機(jī)，3500 r/min離心15 min，取上清液放置于4℃冰箱，檢測(cè)FT3、FT4、SOD、MDA等生化指標(biāo)。

1.6 觀察指標(biāo) 1）觀察大鼠中醫(yī)證候的變化。中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照 《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則 （試行）》［6］及參考文獻(xiàn)［7-8］擬定。主證：大便溏泄；食少。兼證：體質(zhì)量減輕甚則消瘦；精神萎靡，毛色無(wú)光澤；蜷縮扎堆；容易疲勞。具備2項(xiàng)主癥及兼癥中2項(xiàng)即可認(rèn)為符合中醫(yī)證候診斷。2）疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。每日記錄大鼠的糞便性狀、便血情況、體質(zhì)量、體溫等情況，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）［9-10］評(píng)分。3）結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）。大鼠剖腹后立即進(jìn)行肉眼大體結(jié)腸黏膜，用放大鏡觀察腸黏膜有無(wú)充血水腫、糜爛及潰瘍形成［12-13］，進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分［14-15］。4）血清FT3、FT4、SOD、MDA等指標(biāo)。FT3、FT4使用放免法檢測(cè)；SOD、MDA使用分光光度計(jì)法檢測(cè)。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）的評(píng)估指標(biāo)

表2 肉眼觀察結(jié)腸形態(tài)和黏膜損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)性用非參數(shù)（秩和）檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠中醫(yī)證候比較 正常對(duì)照組：第1～3周大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏銳，毛色光亮有澤，每1周體質(zhì)量增加約40 g，大便硬。潰結(jié)組：第1～3周大鼠體質(zhì)量稍有減輕，由180～220 g下降到160～200 g，無(wú)消瘦，稀便甚或膿血便，進(jìn)食可，神態(tài)尚可，毛色稍無(wú)華，無(wú)蜷縮聚堆，活動(dòng)尚靈敏，本組不具備2項(xiàng)主證及2項(xiàng)兼證，不符合中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)。脾腎陽(yáng)虛組：第1～3周逐漸出現(xiàn)大便溏泄，食少，蜷縮聚堆，易疲勞癥狀，體質(zhì)量無(wú)明顯變化，具有主證2項(xiàng)及兼證2項(xiàng)，符合中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)。病證結(jié)合組：灌腸后第1日出現(xiàn)懶動(dòng)，厭食，稀便，第1～3周逐漸出現(xiàn)蜷縮聚堆，體質(zhì)量減輕，由180～220 g下降到155～195 g，消瘦，神態(tài)萎靡，毛色暗淡無(wú)華，解稀便膿血便，與所有主證及兼證一致，符合中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 各組疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分比較 每天記錄大鼠大便性狀、便血、體質(zhì)量、體溫等一般臨床表現(xiàn)，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分。通過(guò)體質(zhì)量下降、糞便性狀、便血積分及體溫對(duì)各組進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3，各組3項(xiàng)積分與正常對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；潰結(jié)組與病證結(jié)合組比較，體質(zhì)量下降、大便性質(zhì)、便血積分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。體溫方面，正常對(duì)照組與潰結(jié)組、脾腎陽(yáng)虛組與病證結(jié)合組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），后兩組大鼠體溫均顯著低于前兩組（P＜0．05），提示番瀉葉苦寒瀉下，極易損失體內(nèi)陽(yáng)氣，再以冰水噴施皮毛和吹風(fēng)處理，對(duì)機(jī)體陽(yáng)氣更易損傷。

表3 各組大鼠DAI比較（±s）

表3 各組大鼠DAI比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與病證結(jié)合組比較，△P＜0.05；與脾腎陽(yáng)虛組比較，▲P＜0.05。下同。

組別 n 體質(zhì)量下降（分） 體溫（℃）大便性狀（分） 便血（分）正常對(duì)照組 1 0潰結(jié)組 1 0脾腎陽(yáng)虛組 1 0 3 6 . 4 1 ± 0 . 9 6△1 . 9 8 ± 0 . 1 9*▲3 6 . 2 7 ± 0 . 8 3△0 . 1 2 ± 0 . 1 6*3 5 . 1 3 ± 0 . 7 7*0 0 0 3 . 8 9 ± 0 . 2 3*▲3 . 1 2 ± 0 . 1 8*▲2 . 6 7 ± 0 . 2 4*0病證結(jié)合組 1 0 2 . 0 6 ± 0 . 2 0*▲3 4 . 9 8 ± 0 . 6 9*4 . 0 5 ± 0 . 1 9*▲3 . 0 7 ± 0 . 2 2*▲

2.3 各組結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）比較 見(jiàn)表4。造模完成后，結(jié)腸黏膜肉眼大體觀察，正常對(duì)照組大鼠腸黏膜皺襞血管紋理清晰，沒(méi)有明顯的糜爛和潰瘍，整個(gè)腸段平均長(zhǎng)度在18 cm以上；潰結(jié)組、病證結(jié)合組兩組大鼠可見(jiàn)不同程度的腸壁增厚粘連，糜爛和潰瘍表面附著有黑黃相兼樣物質(zhì)，周?chē)つこ溲[明顯，整個(gè)腸段長(zhǎng)度縮短，平均長(zhǎng)度在15 cm左右；脾腎陽(yáng)虛組大鼠結(jié)腸黏膜見(jiàn)輕度充血，無(wú)炎癥及潰瘍形成。

表4 各組大鼠CMDI評(píng)分比較（分，±s）

表4 各組大鼠CMDI評(píng)分比較（分，±s）

組別 n 結(jié)腸形態(tài) 結(jié)腸黏膜正常對(duì)照組 1 0 0 0潰結(jié)組 1 0 1 . 4 9 ± 0 . 2 3*4 . 3 7 ± 0 . 3 1*脾腎陽(yáng)虛組 1 0 0 . 0 5 ± 0 . 1 4 0 . 5 6 ± 0 . 2 4病證結(jié)合組 1 0 1 . 6 3 ± 0 . 1 9*4 . 5 2 ± 0 . 2 8*

2.4 各組大鼠血清FT3、FT4、SOD、MDA等檢測(cè)指標(biāo)比較 見(jiàn)表5。FT3、FT4使用放免法檢測(cè)；SOD、MDA使用分光光度計(jì)法檢測(cè)。血清FT3、FT4：脾腎陽(yáng)虛組和病證結(jié)合組均顯著低于正常對(duì)照組和潰結(jié)組 （P＜0.01）。血清SOD、MDA：正常對(duì)照組、潰結(jié)組血清SOD顯著高于脾腎陽(yáng)虛組、病證結(jié)合組 （P＜0.01），血清MDA則顯著降低（P＜0.01）。

3 討 論

歷代醫(yī)家認(rèn)為UC的發(fā)病，濕熱為其主要原因，但本課題組一直致力于中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的基礎(chǔ)與臨床研究，近10年的前期研究發(fā)現(xiàn)大多UC患者表現(xiàn)為脾腎陽(yáng)虛的癥狀為主，實(shí)為病延日久，損傷腎陽(yáng)，命門(mén)火衰，無(wú)力溫煦脾土，最終導(dǎo)致脾腎陽(yáng)虛。已有研究者對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型進(jìn)行過(guò)研究［16］，也有學(xué)者對(duì)脾腎陽(yáng)虛證模型進(jìn)行研究［5，17-18］，但將兩者結(jié)合起來(lái)的UC脾腎陽(yáng)虛模型的制作方法尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此研制該病證動(dòng)物模型對(duì)于加深對(duì)其病理本質(zhì)的認(rèn)識(shí)及開(kāi)創(chuàng)新的治療方法顯得尤為重要。

表5 各組大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比較（±s）

表5 各組大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比較（±s）

與正常對(duì)照組、潰結(jié)組比較，**P＜0.01。

組別 n F T 3（f m o l / m L）F T 4（f m o l / m L） S O D（N U / m L）M D A（n m o l / m L）正常對(duì)照組 1 0潰結(jié)組 1 0脾腎陽(yáng)虛組 1 0 8 . 7 6 ± 0 . 3 4 8 . 3 5 ± 0 . 4 6 6 . 0 6 ± 0 . 6 5*1 1 . 6 8 ± 0 . 2 2 1 7 6 . 3 6 ± 5 . 3 1 1 1 . 3 0 ± 0 . 5 6 1 7 4 . 1 2 ± 8 . 7 2 8 . 7 9 ± 0 . 3 5*1 5 9 . 3 2 ± 6 . 5 5*0 . 2 0 ± 0 . 0 5 0 . 2 2 ± 0 . 0 6 0 . 3 4 ± 0 . 0 4*病證結(jié)合組 1 0 5 . 9 0 ± 0 . 4 6*8 . 3 3 ± 0 . 6 8*1 5 7 . 4 4 ± 9 . 2 1*0 . 3 5 ± 0 . 0 9*

目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中主要通過(guò)觀察動(dòng)物的癥狀，結(jié)合《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》［7］，來(lái)判斷腎陽(yáng)虛模型是否成功。腎陽(yáng)虛模型常會(huì)出現(xiàn)毛發(fā)稀疏、暗淡無(wú)光澤，進(jìn)食飲水減少，反應(yīng)變慢，蜷縮扎堆，消瘦，畏寒、體溫下降，活動(dòng)減少等癥狀。其他生化指標(biāo)主要涉及下丘腦-垂體軸、甲狀腺、生殖系統(tǒng)、腎以及一些其他的血液指標(biāo)、免疫功能等，如常伴有血清FT3、FT4含量明顯下降［19-20］，MDA含量增高、SOD降低［21-22］。脾陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的表現(xiàn)大多與腎陽(yáng)虛證相類似：體質(zhì)量下降，體溫降低，食欲減退，倦怠乏力，嗜臥扎堆，大便溏泄，毛色無(wú)光，個(gè)別動(dòng)物肛門(mén)脫垂，甚則死亡［23］；生化指標(biāo)有：脾細(xì)胞膜蛋白激酶C（PKC）活性明顯降低、胞漿PKC活性明顯增高［24］，血清SOD活性降低［25］，MDA含量增高［26］，結(jié)合脾陽(yáng)虛及腎陽(yáng)虛癥狀及生化指標(biāo)，可以得出脾腎陽(yáng)虛證會(huì)有體溫下降，SOD活性降低，MDA含量增高。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，脾腎陽(yáng)虛組及病證結(jié)合組大鼠體溫、SOD活性顯著低于正常對(duì)照組及潰結(jié)組，血清MDA含量顯著升高，結(jié)果符合脾腎陽(yáng)虛型會(huì)出現(xiàn)的癥狀及生化指標(biāo)的變化。

綜上所述，番瀉葉灌胃及冰水濕身風(fēng)干法造成的脾腎陽(yáng)虛型大鼠，再用TNBS灌腸，從而研制出的脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，對(duì)臨床有實(shí)踐意義。

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Experimental Research of Rat Model with Ulcerative Colitis of Spleen-kidney Yang Deficiency Type

WANG Yipei，ZHU Ying，WANG Xuan. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To investigate establishment of the rat model with ulcerative colitis of Spleen-kidney yang deficiency type based on ulcerative colitis model.Methods：A11 the SD rats were divided randomly into 4 groups，namely the normal control（NC），the Spleen-kidney Yang Deficiency（SKYD），the ulcerative colitis（UC），and the SKYD with ulcerative colitis（SKYDUC）.The rats in NC group had no intervention measures，in UC clystered by TNBS，in SKYD gavaged with folium sennae solution and washed with ice water，then dried their furs with electric fan，and in SKYDUC managed firstly with the same method as SKYD for four weeks，then clystered by TNBS.The following items were observed：the general symptoms and signs，the changes of syndrome of traditional Chinese medicine，colon tissue and serum indicators such as FT3，F(xiàn)T4，MDA，SOD.Results：Compared with the NC and UC group，the differences of the TCM syndrome score，serum FT3，F(xiàn)T4，SOD and MDA in the SKYDUC and SKYD group were statistically significant（P＜0.05）.Compared with the NC and SKYD group，the difference of eye view of colon and colonic mucosa damage in SKYDUC and UC group was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：The method used to induce the model in SKYDCB is feasible in practice.

Ulcerative colitis；Spleen-kidney Yang Deficiency；Combination of disease and syndrome；Animal model；Rats

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1332-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.007

2015-03-20）

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（13A069）；湖南省科技廳一般項(xiàng)目（2013SK3080）

△通信作者（電子郵箱：zhuying089＠126.com）