吳曉紅 楊傳平

（東北林業(yè)大學(xué)交通學(xué)院1，哈爾濱 150040）

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院2，哈爾濱 150040）

松仁蛋白對(duì)小鼠抗氧化能力的影響

吳曉紅1楊傳平2

（東北林業(yè)大學(xué)交通學(xué)院1，哈爾濱 150040）

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院2，哈爾濱 150040）

通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型，研究松仁蛋白對(duì)衰老小鼠的抗氧化作用。隨機(jī)將SPF級(jí)雄性小鼠60只分為正常對(duì)照組（12只）和模型組（48只）。模型組致衰后，按照小鼠體內(nèi)MDA水平分成4組，各組灌胃不同劑量松仁蛋白。測(cè)定各組小鼠血清、肝及腎組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、總超氧化歧化酶（SOD）等指標(biāo)的變化。發(fā)現(xiàn)松仁蛋白顯著的降低了小鼠體內(nèi)MDA生成，增強(qiáng)了機(jī)體SOD、CAT、GSH-Px活力，飼喂劑量中500 mg／（kg·d）影響效果最顯著。松仁蛋白對(duì)延緩小鼠衰老有一定作用。

松仁蛋白 小鼠 抗脂質(zhì)氧化能力

紅松（Pinus konaiensis Sieb et Zucc）松屬松科植物，是我國(guó)東北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，紅松種子是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的堅(jiān)果，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)20%左右，研究發(fā)現(xiàn)紅松仁蛋白具有一定的生理活性功能［1-3］，是一種很好的植物蛋白來源。自20世紀(jì)80年代以來，掀起了一股開發(fā)、研究和利用天然抗氧化劑的熱潮［4-5］，關(guān)于植物蛋白抗氧化作用方面的研究有相關(guān)的研究報(bào)道，大豆蛋白對(duì)大鼠抗脂質(zhì)氧化能力有改善作用［6］，富硒靈芝中不同蛋白提取物具抗氧化活性［7］，小球藻糖蛋白、鷹嘴豆蛋白、白果活性蛋白、核桃蛋白都具有抗氧化活性［8-11］，從紅松仁中提取得到的組成蛋白已經(jīng)初步確定具有清除自由基的作用［12］，本研究主要是研究紅松仁蛋白對(duì)小鼠體內(nèi)MDA生成、機(jī)體SOD、CAT、GSH-Px活力等方面的影響，進(jìn)一步確認(rèn)松仁蛋白的抗氧化活性，為松仁蛋白在功能食品、化妝品和藥品等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

紅松籽：市售；紅松仁蛋白（在松仁總蛋白中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.55%）：自制。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動(dòng)物養(yǎng)殖中心，合格證號(hào)SCXK（黑）2006-008，實(shí)驗(yàn)室許可號(hào) SYXK（黑）2013-012，經(jīng)過東北林業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理管理委員會(huì)同意。

1.1.2 主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）：南京建成生物制劑公司。

1.1.3 主要設(shè)備

722型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；3K-30超速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 松仁蛋白制備

紅松籽去殼脫紅衣，傳動(dòng)桿法碾碎，索氏法脫去脂肪，得到脫脂松仁粉，取一定量的脫脂松仁粉，按1∶20的比例加入蒸餾水，35℃水浴并用增力電動(dòng)攪拌器勻速攪拌 90 min，然后以 4 000 r／min離心10 min，棄沉淀取上清液，上清液調(diào)節(jié)pH值至4.0，靜置30 min，沉淀，以 4 000 r／min離心 10 min，棄上清液取沉淀，將沉淀洗滌，以上操作重復(fù)2遍，合并沉淀透析，在-40℃下預(yù)凍24 h，再轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)干燥，即得松仁蛋白。

1.2.2 松仁蛋白急性毒性試驗(yàn)

霍恩急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法：GB 15193.3—2003。

松仁蛋白的急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)：室溫（22±3）℃，相對(duì)濕度30%～70%，無對(duì)流風(fēng)。選用昆明種健康小鼠48只SPF級(jí)，雌雄各半，體重（18～22）g，隨機(jī)分為4組，每組12只，雌雄各半。設(shè)定4個(gè)劑量組，對(duì)每組小鼠1次灌胃達(dá)到設(shè)定的劑量，灌胃后第2天起計(jì)算，觀察14 d內(nèi)動(dòng)物的死亡情況。

1.2.3 動(dòng)物分組及建立衰老模型

選18～22 g昆明種健康小鼠60只，SPF級(jí)，雄性，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（12只）和模型組（48只），模型組用D-半乳糖1 000 mg／（kg·d）腹腔注射造模，每日1次，連續(xù)6周。取血測(cè)定已造模小鼠血清中MDA含量，按照MDA水平分組。隨機(jī)分為模型對(duì)照組（12只）和高劑量組（12只）、中劑量組（12只）、低劑量組（12只）4組，3個(gè)劑量模型組分別灌服100、500和 1 000 mg／（kg·d）松仁蛋白，連續(xù)灌胃30 d。正常組和模型對(duì)照組灌服同體積的生理鹽水，同時(shí)模型組繼續(xù)腹腔注射相同劑量的D-半乳糖；自由飲食飲水。

1.2.4 松仁蛋白對(duì)小鼠抗氧化作用

各組小鼠連續(xù)灌胃30 d后，最后1次灌胃后禁食12 h，可以自由飲水，斷頭取血，取肝臟和腎臟。

取肝臟和腎臟各0.2 g，分別加入9倍的生理鹽水，用組織勻漿機(jī)勻漿至無塊狀組織存在，將勻漿液倒入離心管，以3 000 r／min于4℃離心15 min，取上清液測(cè)定各指標(biāo)。

血液采集后直接離心，取血清，測(cè)定各指標(biāo)。主要測(cè)定血清、肝及腎組織中MDA含量、SOD活性、CAT活性及GSH-Px的活性和組織中總蛋白含量，各測(cè)定指標(biāo)的測(cè)定參照試劑盒說明方法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 松仁蛋白急性毒性

松仁蛋白急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。在14 d內(nèi)，4個(gè)劑量組均無小鼠死亡，小鼠經(jīng)口灌胃LD50值＞21.5 g／kg，紅松仁水溶性蛋白按照我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬無毒物質(zhì)。

表1 松仁蛋白急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 小鼠肝及腎組織勻漿總蛋白含量

對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各受試組與空白對(duì)照組均沒有顯著差異（P＞0.05），說明松仁蛋白對(duì)小鼠肝、腎組織勻漿的總蛋白含量沒有影響。

2.3 小鼠血清、肝及腎組織勻漿SOD活性

SOD酶是體內(nèi)去除自由基的有效因子，從表3可以看出，正常對(duì)照組與模型組小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型對(duì)照組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的SOD的活力比正常對(duì)照組較顯著降低（P＜0.01），而 100、500和1 000 mg／kg 3個(gè)劑量組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的SOD活力則比模型對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／（kg·d）劑量組較模型對(duì)照組較顯著增加（P＜0.01），血清、肝及腎組織勻漿中SOD活力分別增高22.49%、25.86%和8.63%。從試驗(yàn)的結(jié)果看，松仁蛋白可以作為一種抗氧化劑，能夠增強(qiáng)體內(nèi)的SOD活性，是較理想的抗衰老營(yíng)養(yǎng)品。

表2 小鼠肝組織勻漿和腎組織勻漿總蛋白含量（X±s）

表3 小鼠血清、肝組織勻漿及腎組織勻漿中SOD活性±s）

表3 小鼠血清、肝組織勻漿及腎組織勻漿中SOD活性±s）

注：a：與正常對(duì)照組比較；b：與模型對(duì)照組比較，**較顯著差異（P＜0.01），*顯著差異（P＜0.05）。下同。

1%腎組織勻漿SOD活力12 257.53±23.45 289.53±20.67 219.38±19.98模型對(duì)照組 0 12 198.78±27.17a** 201.18±25.19a** 198.27±25.77a**低劑量模型組 50 12 201.68±30.35b* 231.63±27.52b* 175.98±29.33b*中劑量模型組 100 12 243.49±31.58b** 253.21±29.18b** 215.41±27.78b**高劑量模型組 200 12 226.79±29.45b* 247.53±29.09b* 193.21±26.31b／U／mg prot正常對(duì)照組組別 蛋白劑量／mg／（kg·d） 動(dòng)物數(shù)／只 血清SOD活力／U／mL 1%肝組織勻漿SOD活力／U／mg prot 0*

2.4 小鼠血清、肝及腎組織勻漿CAT活性

羥自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，它對(duì)機(jī)體的破壞性極強(qiáng)，可以被CAT分解，測(cè)定CAT的活性可間接反映機(jī)體清除自由基的能力，衡量組織細(xì)胞抗氧化保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活。CAT分解過氧化氫的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的過氧化氫與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測(cè)定其生成量，可計(jì)算出CAT的活力，各組小鼠血清、肝、腎組織CAT活力見表4。

表4 小鼠血清、肝組織勻漿和腎組織勻漿中CAT活性（X±s）

表5 小鼠血清、肝組織勻漿和腎組織勻漿中GSH-Px活性（X±s）

表6 小鼠血清，肝組織勻漿和腎組織勻漿中MDA含量（X±s）

從表4可以看出，正常對(duì)照組與模型組小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型對(duì)照組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的CAT的活力比正常對(duì)照組的顯著降低（P＜0.05），而100、500和1 000 mg／kg3個(gè)劑量組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的CAT的活力則比模型對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500mg／kg劑量組模型對(duì)照組較顯著增加（P＜0.01），血清、肝及腎組織勻漿中CAT活力分別增高21.5%、28.17%和20.14%。同時(shí)也可以看出松仁蛋白具有清除自由基的能力。

2.5 小鼠血清、肝及腎組織勻漿GSH-Px活性

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，GSH-Px可以促進(jìn)過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成氧化型（GSSG）和水。從表5可看出，正常對(duì)照組與模型組小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型對(duì)照組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的GSH-Px的活力比正常對(duì)照組的顯著降低（P＜0.05）；灌胃松仁蛋白可以提高小鼠肝、腎勻漿和血清中的GSH-Px的活性，100、500和1 000 mg／kg3個(gè)劑量組均能夠較顯著的提高小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的GSH-Px的活力，與模型對(duì)照組比較顯著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／kg劑量組較模型對(duì)照組較顯著增加（P＜0.01），血清、肝及腎組織勻漿中GSH-Px活力分別增高26.16%、19.64%和39.18%，說明食用松仁蛋白可以激活體內(nèi)的GSH-Px的活性。GR酶是催化機(jī)體內(nèi)氧化型GSH還原成GSH，GSH能和氧自由基結(jié)合，有效清除體內(nèi)的自由基，保護(hù)機(jī)體免受自由基的攻擊損害。

2.6 小鼠血清、肝及腎組織MDA含量

MDA是氧自由基氧化細(xì)胞膜上磷脂形成的脂質(zhì)過氧化物的穩(wěn)定存在形式，可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。MDA含量高低可反映氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速率，是了解氧自由基致機(jī)體細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一。

從表6可看出，正常對(duì)照組與模型組小鼠灌喂紅松仁水溶性蛋白30 d后，模型對(duì)照組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的MDA的生成比正常對(duì)照組的MDA的生成較顯著增加（P＜0.01），而 100、500和 1 000 mg／kg3個(gè)劑量組小鼠血清、1%肝勻漿組織和1%腎勻漿組織中的MDA的生成則比模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／kg劑量組與其他劑量組比較，較顯著抑制了MDA生成（P＜0.01）?？梢?，松仁蛋白可有效抑制MDA的生成，對(duì)細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

經(jīng)急性毒性試驗(yàn)證明，松仁蛋白經(jīng)口LD50＞21.5 g／kg，按照我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬無毒的物質(zhì)。松仁蛋白能夠顯著降低小鼠體內(nèi) MDA生成，增強(qiáng)機(jī)體 SOD、CAT、GSH-Px活力，100、500和 1 000 mg／（kg·d）3個(gè)劑量中 500 mg／kg·d劑量影響效果最顯著，結(jié)果表明松仁蛋白具有良好的抗氧化的功能。

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The Effect of Pine Nut Protein on Antioxidant Capacityin Mice

Wu Xiaohong1Yang Chuanping2
（Traffic college，Northeast Forestry University1，Haerbin 150040）
（School of Forestry，Northeast Forestry University2，Haerbin 150040）

Antioxidant effect of pine nut protein was studied through themodel of agingmice by D-galactose.60 SPFmalemicewere randomly divided into normal control（12）andmodel set（48）.After the agingmodelwas established successfully，according to the MDA level inmice，themalemicewere divided into four groups，each group was given different dose pine nut protein.Dfferent antioxidant parameters were measured in serum，liver tissue and kidney tissue from mice.MDA formation were significantly inhibited and SOD，CAT and GSH-Px of blood serum，liver tissue and kidney tissue increased after taking pine nut protein in agingmice.The feeding dose（500mg／（kg·d））had themost significant effect.Pine nut protein could delaymice aging process.

pine nut protein，mice，anti-lipid oxidation capacity

TS209

A

1003-0174（2015）07-0028-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)專項(xiàng)（DL11BA13），黑龍江省博士后研究項(xiàng)目（LBH-Z11269）

2014-02-19

吳曉紅，女，1977年出生，副教授，天然產(chǎn)物有效成分功能機(jī)理及功能性食品開發(fā)

楊傳平，男，1957年出生，教授，林木育種