復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

選擇性剪接基因RBFOX1在食管鱗癌中的研究

鄧家營，趙快樂

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：選擇性剪接是基因表達(dá)中的重要調(diào)控機(jī)制，異常的剪接可導(dǎo)致細(xì)胞周期異常、癌基因轉(zhuǎn)錄因子激活及抑癌基因轉(zhuǎn)錄因子失活；異常剪接與腫瘤發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要組成部分，基因啟動子的異常甲基化可導(dǎo)致基因沉默，抑癌基因和DNA修復(fù)基因的高甲基化參與多種腫瘤的發(fā)生；另外DNA甲基化還是選擇性剪接的關(guān)鍵參數(shù)，DNA異常甲基化影響選擇性剪接的平衡。本研究通過對食管鱗癌組織標(biāo)本中RBFOX1(RNA binding protein, fox-1 homolog 1)選擇性剪接基因的甲基化水平和表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其臨床應(yīng)用價值。方法：在149例配對的食管鱗癌及癌旁組織中，運(yùn)用MassARRAY對RBFOX1基因的甲基化水平進(jìn)行檢測，并從同一批樣品中選取42對組織采用RT-PCR進(jìn)行RBFOX1基因的mRNA表達(dá)分析，統(tǒng)計甲基化水平與食管鱗癌主要臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：在食管鱗癌組織標(biāo)本中，RBFOX1的甲基化水平為41.8%，明顯低于對應(yīng)癌旁組織的68.3%。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；RBFOX1的甲基化水平與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒以及腫瘤的分化、分期等無明顯相關(guān)。依據(jù)癌組織中甲基化水平閾值（33.6%）=Mean(癌旁組織)-2.5SD(標(biāo)準(zhǔn)差)，將研究對象分為兩組，低于閾值的一組定義為組1，高于閾值的為組2。組1和組2的5年總體生存率(overall survival，OS)為57.0%和35.7%。差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06)。組1和組2的5年無進(jìn)展生存率(progression-free survival，PFS)為48.7%和28.9%。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。多因素分析結(jié)果顯示僅TNM分期為生存的獨(dú)立預(yù)測因子。結(jié)論：選擇性剪接基因RBFOX1在食管鱗癌組織中的甲基化水平和表達(dá)水平均低于癌旁組織，RBFOX1啟動子區(qū)的甲基化水平不能作為生存分析的預(yù)測因子。

食管鱗癌；選擇性剪接；甲基化；表達(dá)；RBFOX1

流行病學(xué)資料顯示，我國食管癌發(fā)病率和死亡率分別占全部惡性腫瘤的第6位和第4位［1］。在腫瘤診斷、分期及治療方面的研究取得了進(jìn)展，使患者的生存率有了一定的提高，但20%～30%的5年生存率尚不令人滿意，所以迫切需要探究食管癌的確切發(fā)病機(jī)制以尋找更加有效的治療方法。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與癌基因的表達(dá)密切相關(guān)，選擇性剪接(alternative splicing)和DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要生物學(xué)過程。

選擇性剪接是真核生物基因表達(dá)中的一種高效、精準(zhǔn)的調(diào)控機(jī)制，通過在pre-mRNA上的識別定位，剪接體能夠準(zhǔn)確地切除內(nèi)含子序列，將不同的外顯子序列拼接到一起，以產(chǎn)生不同的成熟mRNA［2］。選擇性剪接現(xiàn)象廣泛存在于超過90%的人類基因表達(dá)過程中，在細(xì)胞生長和組織分化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。選擇性剪接產(chǎn)物的自然平衡是維持正常機(jī)體功能的前提，異常的剪接過程將導(dǎo)致平衡破壞，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾?。?］。研究表明基因選擇性或異常剪接所產(chǎn)生的蛋白異構(gòu)體可以參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子激活或失活等生命過程，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)［5］。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾。在哺乳動物基因組中，DNA甲基化的主要位點(diǎn)是CpG二核苷酸，尤其是基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化，可引起基因轉(zhuǎn)錄水平沉默。抑癌基因和DNA修復(fù)基因的高甲基化、重復(fù)序列DNA的低甲基化與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)［6］。已證明維甲酸受體β2啟動子的異常甲基化與食管鱗癌的發(fā)生、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］； F-box蛋白32 (F-box protein 32，F(xiàn)BXO32)的基因啟動子異常甲基化促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生并產(chǎn)生不良預(yù)后［8］。因此，對基因異常甲基化的研究可探求食管鱗癌治療的新靶點(diǎn)，豐富食管鱗癌的治療手段。另外，有研究表明DNA甲基化還是剪接過程中的一個關(guān)鍵參數(shù)，它影響選擇性剪接的類型、剪接的位點(diǎn)，進(jìn)而影響外顯子的剪接潛能［9］。DNA甲基化既能通過DNA結(jié)合蛋白來影響剪接結(jié)果，還能通過改變組蛋白的修飾來調(diào)控選擇性剪接過程［10］。

RNA結(jié)合蛋白同源體1(RNA binding protein, fox-1 homolog 1，RBFOX1)基因位于16p13.3，大小約1694 246 bp。編碼蛋白通過與5’-UGCAUGU-3’元件結(jié)合來調(diào)節(jié)組織特異性的外顯子剪接。研究表明RBFOX1的靶基因包括降鈣素基因、纖連蛋白基因和上皮特異性纖維母細(xì)胞生長因子受體基因等［11-12］。RBFOX1編碼的蛋白質(zhì)可作用于肌動蛋白、肌凝蛋白、驅(qū)動蛋白和微管結(jié)合蛋白等，參與細(xì)胞構(gòu)架、變形和遷移［13］。有研究報道RBFOX1基因在結(jié)腸癌組織中存在缺失突變，突變頻率約為1.5%，缺失突變的發(fā)生與結(jié)腸癌的發(fā)病呈正相關(guān)［14］；研究還證明RBFOX1基因是惡性膠質(zhì)瘤的組織特異性選擇剪切基因，RBFOX1基因不僅通過編碼的蛋白質(zhì)影響細(xì)胞的生長和運(yùn)動，還通過影響網(wǎng)格蛋白輕鏈B (clathrin light chain B，CLTB)進(jìn)而控制細(xì)胞遷移［15］。RBFOX1基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過程中的作用值得關(guān)注，截止目前，尚無RBFOX1在食管鱗癌中的研究報道。

1 材料和方法

1.1 研究對象和標(biāo)本來源

組織標(biāo)本均來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2007—2010年間的食管癌手術(shù)患者，共149例。其中男性134例，女性15例，年齡37～76歲，平均年齡58.4歲。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及其距離癌組織邊緣5 cm以上的癌旁正常組織(adjacent normal tissue，ANT)。全部患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。術(shù)中立即取材，標(biāo)本放入液氮中速凍后-80 ℃條件下保存以提取DNA及RNA。術(shù)后常規(guī)病理診斷證實(shí)癌組織均為鱗狀細(xì)胞癌。按照國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer，UICC)7th標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，149例腫瘤患者中Ⅰ期9例(6.0%)，Ⅱ期26例(17.4%)，Ⅲ期114例(76.6%)。腫瘤組織學(xué)分級為：高分化14例(9.4%)，中分化88例(59.1%)，低分化47例(31.5%)。標(biāo)本獲得了倫理委員會批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提和DNA的亞硫酸鹽處理

本研究采用按QIAmp DNA迷你試劑盒(德國Qiagen公司)試劑盒進(jìn)行DNA 提取，每份標(biāo)本(癌組織/癌旁組織)取25 mg。應(yīng)用 EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒(德國Qiagen公司)試劑盒進(jìn)行亞硫酸鹽處理，癌組織和癌旁組織DNA各400～500 ng。均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 甲基化水平檢測

PCR反應(yīng)體系參照甲基化PCR試劑盒(Sequenom)進(jìn)行加樣：加入經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板1 μL，10×緩沖液0.5 μL，20 mmol/L的MgCl20.2 μL，20 mmol/L的dNTPs 0.04 μL，5 nmol/L的上、下游引物各0.4 μL，Hotstar Taq DNA聚合酶0.04 μL，用雙蒸水調(diào)整體系，使最終體積為5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min，1個循環(huán)；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)；72 ℃ 3 min。反應(yīng)結(jié)束后加入2 μL稀釋10倍的SAP酶。反應(yīng)條件：37 ℃，20 min；85 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物加入到5 μL的T-cleavage反應(yīng)體系中：5×緩沖液0.89 μL，T-cleavage Mix 0.22 μL，DTT 0.22 μL，TRase DNA聚合酶0.4 μL，RNase A 0.06 μL；反應(yīng)條件37 ℃，3 h；反應(yīng)結(jié)束后加水20 μL，上機(jī)準(zhǔn)備完成。用MassARRAY(美國Sequenom公司)檢測樣品的甲基化水平，設(shè)定MassARRAY的檢測閾值為1%，ΔMean定義為RBFOX1在癌旁組織和癌組織中甲基化水平的差值。甲基化特異性PCR正向引物為5’-AGGAAGAGAGTTGATTTTAGAGATTTGTTGTGAGAA-3’；反向引物為5’-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAAAAAAACCAAAAAACCAAATAACA-3’。

1.2.3 RT-PCR檢測RBFOX1 mRNA的表達(dá)

按TRIzol試劑說明書提取總RNA(美國Invitrogen公司)，并參照Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書的比例加樣，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR參照FastStart DNA Master SYBR Green aster Mix(Roche公司)試劑盒加樣，反應(yīng)體系使用ABI ViiA TM7 system(美國Life Technologies公司)進(jìn)行擴(kuò)增，所有樣品均重復(fù)檢測3次。RBFOX1上游引物為5’-AGCTAGTTTTGCACCCTGCTA-3’，下游引物為5’-TTGGTCCGTGTTATTGGCACC-3’。GAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物為5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物為5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3’。本實(shí)驗通過比較ΔCt的方法對RBFOX1基因表達(dá)量進(jìn)行相對分析。

1.3 隨訪

通過門診及電話方式隨訪，隨訪時間自手術(shù)日起截止至2013年12月31日。隨訪時間為2～72個月，中位隨訪時間為20個月。常規(guī)行胸片、食管鋇餐及內(nèi)鏡檢查等，酌情行CT、PET/CT等影像學(xué)檢查，明確有無局部的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。食管鱗癌組織或配對癌旁組織基因甲基化水平差異采用t檢驗；各基因甲基化情況與食管鱗癌主要臨床病理特征之間的關(guān)系運(yùn)用Fisher精確檢驗；Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，Cox回歸進(jìn)行多因素分析；所有檢驗均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RBFOX1基因啟動子異常甲基化

利用Vector NTI Advance 11(美國Invitrogen公司)，結(jié)合MassARRAY芯片的要求：所分析的區(qū)域分布有5～10個CpG島時，芯片的檢測效果最佳。本研究比較了RBFOX1基因啟動子區(qū)域不同位置的CpG島密度，選擇了chr16:6014214-6014616 (［GRCh37/hg19］)進(jìn)行分析(圖1)，該區(qū)域包含6個CpG位點(diǎn)(CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5和CpG6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個CpG位點(diǎn)均被檢測到，且發(fā)現(xiàn)癌組織中所有CpG位點(diǎn)的甲基化水平顯著低于癌旁組織(表1；圖2A)，癌組織中的平均甲基化水平顯著低于癌旁組織。兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(41.8% vs 68.3%，P＜0.000 1)。

圖1 RBFOX1基因啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)示意圖Fig.1 The schematic diagram of the CpG sites in the RBFOX1 promoter

表1 RBFOX1基因啟動子區(qū)各CpG位點(diǎn)的甲基化水平Tab. 1 Methylation status (%) of the detected sites of RBFOX1 promoter

2.2 RBFOX1基因在癌組織中的表達(dá)

為探究RBFOX1基因在食管鱗癌中的表達(dá)情況，本研究從149例配對的癌組織和癌旁組織中選取了42例配對的組織進(jìn)行mRNA表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，癌組織中RBFOX1基因表達(dá)顯著降低(約為癌旁組織中表達(dá)量的19%)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.000 1，圖2B)。

2.3 RBFOX1啟動子甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Δmean定義為RBFOX1在癌旁組織和癌組織中甲基化水平的差值，分析Δmean與性別、年齡、吸煙、飲酒、神經(jīng)侵犯、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、分化和病灶位置的相關(guān)性。結(jié)果顯示所分析的啟動子區(qū)域RBFOX1所有位點(diǎn)的平均甲基化水平差異與上述臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)(P＞0.05，表2)，對各個位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)CpG6位點(diǎn)的甲基化水平差異與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈臨界負(fù)相關(guān)（P=0.05，r=-0.16）；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織甲基化水平差異較大（36.9% vs 26.3%）；其他位點(diǎn)無明顯相關(guān)。

2.4 RBFOX1啟動子甲基化與預(yù)后的關(guān)系

參照文獻(xiàn)中的方法［16］，在本研究中設(shè)定癌組織中甲基化水平cut-off(閾值)=Mean(癌旁組織)-2.5SD(標(biāo)準(zhǔn)差)，Mean(癌旁組織)=68.3%, SD=0.139，cut-off=33.6%。依據(jù)cut-off值將研究對象分為兩組，低于閾值的一組定義為組1(Group 1)；高于閾值的為組2(Group 2)。兩組1、3和5年的總生存率(overall survival，OS)分別為90.7% vs 79.7%、66.1% vs 50.6%和57.0% vs 35.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06)；無進(jìn)展生存率(progression-free survival，PFS)分別為81.9% vs 70.4%、56.9% vs 36.8%和48.7% vs 28.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。單因素分析顯示TNM分期是影響總體生存的因子；TNM分期、血管侵犯和甲基化水平是影響無進(jìn)展生存的因子(表3)；將單個危險因素納入Cox回歸進(jìn)行多因素分析，發(fā)現(xiàn)TNM分期是總體生存和無進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)測因子，甲基化水平不是總體生存和無進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)測因子(P=0.316，P=0.121；表3)。

圖2 RBFOX1基因CpG位點(diǎn)甲基化水平及RBFOX1基因的相對表達(dá)量Fig. 2 Methylation level at CpG sites and relative expression of RBFOX1 gene.

表2 RBFOX1甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 Association between methylation difference (%) of RBFOX1 and clinicopathological parameters

圖3 RBFOX1基因可能的靶點(diǎn)和通路

表3 總體生存率和無進(jìn)展生存的單因素和多因素分析Tab. 3 Univariate and multivariate analysis of OS and PFS

3 討 論

已發(fā)現(xiàn)許多疾病與mRNA前體選擇性剪接有關(guān)。選擇性剪接更是以多種方式參與腫瘤的發(fā)生：選擇性剪接影響癌基因的活化［17］；選擇性剪接導(dǎo)致腫瘤抑制基因的失活；選擇性剪接還參與腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤［18］。研究選擇性剪接基因可使人們更好地理解基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程中的多樣化選擇，并為腫瘤的病因?qū)W研究提供新的思路。

RBFOX1基因的表達(dá)情況在腫瘤研究中有所報道。有研究表明在結(jié)腸癌中RBFOX1基因存在缺失突變，RBFOX1基因在癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織中的表達(dá)水平［14］；在卵巢癌和乳腺癌中RBFOX1基因的mRNA水平仍然低于癌旁組織中的水平［19］，這些研究在一定程度上支持本研究的發(fā)現(xiàn)：RBFOX1基因在食管鱗癌中的表達(dá)水平比癌旁組織中的表達(dá)水平顯著降低。基因的表達(dá)受多種因素的影響，基因缺失突變和基因啟動子異常甲基化都是其中的影響因素?；騿幼拥母呒谆鶎?dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默進(jìn)而降低基因的表達(dá)，兩者常呈負(fù)相關(guān)［20-21］。本研究中RBFOX1基因在癌組織中甲基化水平和表達(dá)量均低于癌旁組織，造成這種現(xiàn)象可能的原因有：①鱗癌中存在RBFOX1基因缺失突變，相對于缺失突變，甲基化可能不是影響RBFOX1基因表達(dá)的最關(guān)鍵的因素；②本研究中6個CpG位點(diǎn)對RBFOX1基因的表達(dá)影響較小。有觀點(diǎn)認(rèn)為，甲基化CpG位點(diǎn)的密度會影響甲基化對基因表達(dá)的作用［22］。有研究報道，基因甲基化與表達(dá)之間的關(guān)系，所選定的區(qū)域分布有25個CpG位點(diǎn)［23］。③RBFOX1基因的表達(dá)與細(xì)胞特異性有關(guān)。當(dāng)然在食管鱗癌中是不是存在RBFOX1基因缺失突變還需要測序分析來證實(shí)。

由于RBFOX1基因調(diào)節(jié)的基因和靶點(diǎn)較多［11-12,24］，可以看出，RBFOX1基因既參與腫瘤生成過程也參與抑制腫瘤的過程。目前尚不明確RBFOX1基因在食管鱗癌中的特異性靶點(diǎn)，所以需要進(jìn)一步的實(shí)驗來探究RBFOX1對食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的影響，以及RBFOX1基因啟動子低甲基化對食管鱗癌功能的影響。

基因的異常甲基化多與臨床病理的特征相關(guān)，在食管鱗癌中有研究表明基因異常甲基化與分化、腫瘤侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)［7-8,25］。在本研究所分析的6個CpG位點(diǎn)中，CpG6位點(diǎn)甲基化水平差異與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)臨界相關(guān)，甲基化水平差異較大的腫瘤易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與異常甲基化促進(jìn)惡性表型發(fā)生的研究結(jié)果相一致［16］。本研究中RBFOX1基因其他位點(diǎn)的異常甲基化與各臨床特征無明顯相關(guān)性，可能的原因與所選取的分析區(qū)域有關(guān)；也可能與RBFOX1基因?qū)τ谑彻荀[癌分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等影響較小有關(guān)；還可能是研究的樣本量的影響。比較了不同甲基化水平下患者的預(yù)后：在單因素分析中，甲基化水平高于33.6%的患者5年生存率和無進(jìn)展生存率低于甲基化水平低于33.6%的患者；但在多因素分析中，僅TNM分期是總體生存和是無進(jìn)展生存率的獨(dú)立預(yù)測因子，所分析的啟動子區(qū)域的甲基化水平不能作為生存分析的預(yù)測因子。

總之，本研究結(jié)果表明，在食管鱗癌中RBFOX1基因甲基化水平和表達(dá)水平都低于正常食管組織，所分析的啟動子區(qū)域chr16:6014214-6014616(［GRCh37/hg19］)的甲基化水平不能作為預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

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Research of the alternative splicing gene RBFOX1 in esophageal squamous cell carcinoma

DENG Jiaying, ZHAO Kuaile (Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZHAO Kuaile E-mail: kuaile_z@sina.com

Background and purpose:Alternative splicing is an important regulation mechanism of gene expression. Aberrant alternative splicing is associated with dysregulation of the cell cycle, activation of oncogenes and inactivation of the tumor suppressor genes. Thus, it is closely correlated with the pathogenesis and progression of various tumors. DNA methylation is an important part of epigenetic phenomena. Aberrant methylation of the gene promoter can result in gene silencing. Hypermethylation of tumor suppressor genes and DNA repair genes correlates with the onset of many different cancers. Additionally, DNA methylation acts as a pivotal factor for alternative splicing. Aberrant methylation disrupts the stabilization of the alternative splicing. This study investigated the promoter methylation and expression of RNA binding protein, fox-1 homolog 1 (RBFOX1) gene in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), and to elucidate its role in ESCC.Methods:MassARRAY approach and RT-PCR were used respectively to examine the methylation level of RBFOX1 gene and its expression at mRNA level in tumors and corresponding adjacent normal tissues. The correlation between methylation level and clinicopathological features was analyzed.Results:RBFOX1 methylation level and mRNA expression in tumor tissues were significantly lower than those in corresponding adjacent normal tissues (41.8% vs 68.3%, P＜0.01). No significant correlation was observed between methylation level and clinicopathological features. The cut-off (33.6%) was calculated as the mean of the normal samples to which we applied 2.5 SD. According to the cut-off value, the object of the study was divided into two groups. The methylation level lower than the cut-off was defined as group 1; methylation level higher than the cut-off was defined as group 2. The 5-year overall survival rates of the two groups were 57.0% and 35.7%, respectively (P=0.06); 5-year progression-free survival rates were 48.7% and 28.9%, respectively (P=0.03). However, the multivariate analysis results indicated that TNM stage was the independent factor of prognosis.Conclusion:The methylation level and mRNA expression of RBFOX1 in tumor specimens are significantly lower than those in corresponding adjacent normal tissues. The methylation level of the RBFOX1 promoter is not an independent factor of prognosis.

Esophageal squamous cell carcinoma; Alternative splicing; Methylation; Expression; RBFOX1

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.06.001

R735.1

A

1007-3639(2015)06-0401-08

2015-02-06

2015-04-15）

國家自然科學(xué)基金資助項目(21172043)。

趙快樂 E-mail:kuaile_z@sina.com