李智敏,羅喜平,曾俐琴,彭秀紅,王意,王澤華
1. 廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣東省婦幼保健院婦科,廣東 廣州 510010;
2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科, 湖北 武漢 430022
hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451通過調(diào)控MDRl/P-gp的表達(dá)和功能參與卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞耐藥
李智敏1,羅喜平1,曾俐琴1,彭秀紅1,王意1,王澤華2
1. 廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣東省婦幼保健院婦科,廣東 廣州 510010;
2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科, 湖北 武漢 430022
背景與目的:腫瘤細(xì)胞耐藥是臨床化療失敗的主要原因,微小RNA(microRNA,miRNA)在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與耐藥關(guān)系密切。本研究旨在探討卵巢癌及乳腺癌細(xì)胞中hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451的表達(dá)差異及其與耐藥的關(guān)系。方法:用濃度遞增法建立卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞系A(chǔ)2780/Taxol;頸環(huán)狀引物實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop quantitative real-time PCR,stem-loop RT-PCR)檢測卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol和親本細(xì)胞A2780以及乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM和親本細(xì)胞MCF-7中hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451的表達(dá);利用LipofectamineTM2000分別將成熟miRNA27a的模擬物、阻遏物及陰性對照(negative control,NC)RNA轉(zhuǎn)染A2780和A2780/Taxol細(xì)胞,將成熟miRNA451的模擬物及NC轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞;RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá);蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達(dá);采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果:miRNA27a在A2780/Taxol細(xì)胞中高表達(dá),與A2780細(xì)胞相比,表達(dá)增高2.2±0.30倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miRNA451在MCF-7/ADM細(xì)胞中低表達(dá),與MCF-7細(xì)胞相比,表達(dá)降低84%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A2780/Taxol細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA27a阻遏物后,MDR1 mRNA表達(dá)明顯下降,與轉(zhuǎn)染NC組相比,表達(dá)下降(39±0.14)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P-gp相對表達(dá)量[(26±5.3)%)]與轉(zhuǎn)染NC組的P-gp相對表達(dá)量[(43±6.7)%]比較,下降39%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對紫杉醇的敏感性增加,半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.53 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組IC50(6.8 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA27a模擬物后,細(xì)胞的MDR1 mRNA表達(dá)升高,與轉(zhuǎn)染NC組相比,升高(121±0.11)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞對紫杉醇的敏感性下降,IC50為0.2 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組IC50(0.06 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MCF-7/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物后,MDR1 mRNA表達(dá)明顯下降,與轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞相比,表達(dá)下降(65±12)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);P-gp相對表達(dá)量[(31±19)%)]與轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞P-gp相對表達(dá)量[(83±12)%]相比,下降62%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對阿霉素的敏感性增加,IC50為4.61 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞IC50(26 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol和乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM中,miRNA27a和miRNA451分別異常表達(dá),它們可能分別通過間接或直接作用于MDR1/P-gp,參與腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生、發(fā)展。
卵巢癌;乳腺癌;紫杉醇;阿霉素;微小RNA;耐藥
卵巢癌和乳腺癌是女性常見惡性腫瘤,嚴(yán)重危害婦女生命健康。目前,手術(shù)切除、放療和化療是治療惡性腫瘤的常規(guī)方法。其中,化療在治療惡性腫瘤中占有重要地位,對于可以行手術(shù)切除的早期惡性腫瘤,化療的輔助治療可以預(yù)防或延緩腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。對于中晚期不能行手術(shù)治療的惡性腫瘤,化療則是主要的治療手段,可以提高患者的生存率和生存質(zhì)量。然而,腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是臨床化療失敗的主要原因,患者一旦出現(xiàn)耐藥,臨床無有效干預(yù)手段,預(yù)后較差,有資料顯示90%惡性腫瘤患者死于耐藥[1]。
近年來,一類新的非蛋白質(zhì)編碼微小RNA (microRNA,miRNA)的發(fā)現(xiàn),為腫瘤耐藥機(jī)制的研究提供了新的思路。miRNA是一類內(nèi)源性,長約19~23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced siencing complex,RISC)結(jié)合后,通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)完全或不完全配對,促進(jìn)目標(biāo)mRNA降解或者翻譯抑制[2-3]。通過這種負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá),miRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及新陳代謝等過程,而且還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)[4-7]。目前已確認(rèn)人類基因組中的miRNA約500種,至少有200多種miRNA序列與腫瘤密切相關(guān)[8]。隨著研究的深入,在多種腫瘤耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)異常。例如在卵巢癌耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA214、miRNA27a、miRNA335,miRNA30c和miRNA130a表達(dá)異常;在乳腺癌耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA221、miRNA222、miRNA328和miRNA451表達(dá)異常。這些表達(dá)異常的miRNA可能以癌基因或抑癌基因角色參與耐藥的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究旨在通過分析卵巢癌和乳腺癌耐藥細(xì)胞中hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451的表達(dá)差異及其與耐藥相關(guān)蛋白之間的調(diào)控關(guān)系,進(jìn)一步探討惡性腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制,有利于臨床采取有效措施逆轉(zhuǎn)耐藥,提高腫瘤患者的生存率。建立
1.1 主要試劑
卵巢癌親本細(xì)胞株A2780由本實(shí)驗(yàn)室保存,耐藥細(xì)胞株A2780/Taxol通過紫杉醇誘導(dǎo),濃度遞增法獲得。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADM均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。RPMI 1640及胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司;紫杉醇(濃度為6 mg/mL)購自美國百時(shí)美施貴寶公司;阿霉素(10 mg)購自意大利法瑪西亞公司;鼠抗人P-糖蛋白(P-glycoprtein,P-gp)單克隆抗體購自美國Calbiochem公司;羊抗鼠抗體購自美國Santa Cruz公司;CelLyticTMM 細(xì)胞裂解液購自美國Sigma公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;miRNA純化試劑盒,miRNA定量PCR試劑盒,成熟miRNA27a的模擬物、阻遏物、miRNA451的模擬物及陰性對照(negative control,NC)RNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
親本細(xì)胞株A2780和MCF-7以及耐藥細(xì)胞株A2780/Taxol和MCF-7/ADM分別于含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長。向A2780/Taxol細(xì)胞和MCF-7/ADM細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度為12 nmol/L的紫杉醇和0.34 μmol/L的阿霉素以維持細(xì)胞耐藥性,在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前兩周,細(xì)胞脫離藥物。
1.2.2 卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株A2780/Taxol的
首先將指數(shù)生長期的卵巢癌親本細(xì)胞A2780培養(yǎng)于含有10 nmol/L紫杉醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中,連續(xù)作用24 h后,換不含藥新鮮培養(yǎng)基,敏感細(xì)胞逐漸死亡,待存活細(xì)胞恢復(fù)正常生長,融合達(dá)80%后,以10、20、40、80、160、320、640 nmol/L濃度梯度逐漸加大紫杉醇誘導(dǎo)濃度,如此反復(fù)持續(xù)誘導(dǎo)10個(gè)月,挑選出經(jīng)640 nmol/L紫杉醇作用后存活的A2780細(xì)胞克隆,培養(yǎng)此細(xì)胞克隆,篩選出能在含12 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的單細(xì)胞克隆,即A2780/Taxol細(xì)胞,并擴(kuò)大培養(yǎng)該細(xì)胞克隆,即得到卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株A2780/Taxol。
1.2.3 頸環(huán)狀引物實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop quantitative real-time PCR,stemloop RT-PCR)檢測腫瘤細(xì)胞中hsa-miRNA27a和hsa-miRNA451表達(dá)
用Trizol試劑提取對數(shù)生長期的細(xì)胞總RNA,隨后用miRNA純化試劑盒分離,純化小RNA,即miRNA。用Hairpin-itTMmiRNA RTPCR試劑盒檢測miRNA表達(dá)水平,包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RT-PCR檢測兩個(gè)步驟。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為20 μL,主要包含stem-loop miRNART primers 60 nmol/L及純化的miRNA 20 ng等,反應(yīng)條件為16 ℃ 30 min,42 ℃30 min,85 ℃ 10 min。RT-PCR體系中主要包含10 μL的2×SYBR Green RT-PCR master mix及miR特異引物0.40 μL(表1)等共20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7300 RT-PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min后,以95 ℃ 12 s,62 ℃ 60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán),在62 ℃檢測熒光強(qiáng)度。U6 snRNA為檢測miRNA27a和miRNA451的內(nèi)參照。結(jié)果分析采用2?△△CT方法,△△CT=(CTmiRNA–CTU6)實(shí)驗(yàn)組–(CTmiRNA–CTU6)對照組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
表1 miRNA27a、miRNA451和U6正反向引物序列Tab. 1 List of primers sequences for miRNA27a, miRNA451 and U6
1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
將對數(shù)生長期的細(xì)胞以3.5×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板上。待細(xì)胞貼壁生長匯合至50%時(shí),分別取成熟miRNA27a的模擬物、阻遏物、NC各100 pmol和LipofectamineTM2000 5 μL混勻后轉(zhuǎn)染A2780和A2780/Taxol細(xì)胞;取成熟miRNA451的模擬物、NC各100 pmol和LipofectamineTM2000 5 μL混勻后轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染NC作為陰性對照,具體操作按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。
1.2.5 RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)Trizol提取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞的總RNA,用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),具體操作按說明書進(jìn)行。RT-PCR的體積為25 μL,體系主要包括2×SYBR Green RT-PCR Master Mix 12.5 μL,模板cDNA 2 μg和上、下游引物各0.3 μmol/L(表2)。RT-PCR在ABI 7300 RT-PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件:95 ℃3 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);每1個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果分析采用2?△△CT方法。
1.2.6 蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞P-gp的表達(dá)
表2 MDR1和β-actin上、下游引物序列Tab. 2 List of primers sequences for MDR1 and β-actin
用CelLyticTMM細(xì)胞裂解液,裂解對數(shù)生長期的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞,將60 μg蛋白質(zhì)經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)聚至硝酸纖維素膜,封閉2 h后,加入鼠抗人P-gp一抗(1:200)溫育過夜,加入與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體(1:5 000),室溫溫育1 h后,用增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence,ECL)試劑盒顯色,壓片顯影。用Quantity One軟件對各條帶進(jìn)行灰度分析,計(jì)算P-gp/β-actin比值,以此表示P-gp的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況
將轉(zhuǎn)染miRNA27a阻遏物、模擬物及NC 24 h后的A2780和A2780/Taxol細(xì)胞,及轉(zhuǎn)染miRNA451的模擬物及NC 24 h后的M C F-7/A D M細(xì)胞,以8.0×1 03個(gè)/孔接種至9 6孔板,細(xì)胞貼壁后A 2 7 8 0細(xì)胞加入終濃度為0.01、0.05、0.25、1.25和7.5 μmol/L的紫杉醇;A2780/Taxol細(xì)胞加入終濃度為0.04、0.2、0.9、5和23 μmol/L的紫杉醇;MCF-7/ADM細(xì)胞加入終濃度為0、0.5、2.7、13.7、68.9和344.8 μmol/L的阿霉素,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白組對照。培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),37 ℃溫育4 h后棄上清液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,用自動(dòng)酶標(biāo)平板閱讀儀以570 nm波長讀取吸光度(D)值。計(jì)算細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組各濃度細(xì)胞孔D值/空白對照組細(xì)胞孔D值)×100%,并繪制藥物劑量反應(yīng)曲線,以Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料的結(jié)果用x±s表示,兩組數(shù)據(jù)的比較采用成組t檢驗(yàn),兩組以上數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 miRNA27a和miRNA451在卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)
Stem-loop RT-PCR結(jié)果顯示,miRNA27a在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol中高表達(dá),與卵巢癌親本細(xì)胞A2780相比,表達(dá)增高2.2±0.30倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1A)。miRNA451在乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM中顯著低表達(dá),與乳腺癌親本細(xì)胞MCF-7相比,表達(dá)降低84%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1B)。同時(shí),miRNA27a在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADM中表達(dá)無差異,miRNA451在卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/Taxol中表達(dá)無差異。
2.2 卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中MDR1 mRNA的表達(dá)
2.2.1 轉(zhuǎn)染后卵巢癌A2780和A2780/Taxol細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)
RT-PCR檢測結(jié)果顯示,A2780/Taxol細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA27a阻遏物后,MDR1 mRNA表達(dá)水平明顯下降,與轉(zhuǎn)染NC組相比,表達(dá)下降(39±0.14)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2A)。A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA27a模擬物后,MDR1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,與轉(zhuǎn)染NC組相比,表達(dá)增高(121±0.11)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。
2.2.2 轉(zhuǎn)染前、后MCF-7/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA的表達(dá)
RT-PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物組細(xì)胞的MDR1 mRNA表達(dá)明顯下降,與轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前MCF-7/ADM組細(xì)胞相比,MDR1 mRNA表達(dá)無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。
圖1 miRNA27a和miRNA451在卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 1 The expressions of miRNA27a and miRNA451 in ovarian cancer and breast cancer cell
圖2 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miRNA27a模擬物、阻遏物和NC后A2780/Taxol和A2780細(xì)胞中MDR1 mRNA的表達(dá)變化Fig. 2 Expression levels of MDR1 mRNA in A2780/Taxol and A2780 cells transfected with mimics or inhibitors of miRNA27a or NC as control were detected by RT-PCR
圖3 RT-PCR檢測MCF-7/ADM細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物、NC的MCF-7/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA的表達(dá)變化Fig. 3 Expression levels of MDR1 mRNA in MCF-7/ADM cells and MCF-7/ADM cells transfected with mimics of miRNA451 or NC as control were detected by RT-PCR
2.3 卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中P-gp表達(dá)的表達(dá)
2.3.1 P-gp在卵巢癌A2780和A2780/Taxol細(xì)胞中的表達(dá)
Western blot檢測結(jié)果顯示,P-gp在A2780/Taxol細(xì)胞中高表達(dá),而在A2780細(xì)胞中未檢測出P-gp蛋白的表達(dá)(圖4A)。A2780/ Taxol細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC后,P-gp表達(dá)為(43±6.7)%,轉(zhuǎn)染miRNA27a阻遏物后,P-gp表達(dá)下降為(26±5.3)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miRNA27a模擬物后,P-gp表達(dá)與轉(zhuǎn)染NC的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖5)。
2.3.2 P-gp在乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADM細(xì)胞中的表達(dá)
Western blot檢測結(jié)果顯示,在MCF-7細(xì)胞中未檢測出P-gp表達(dá),而在MCF-7/ADM細(xì)胞中P-gp高表達(dá)(圖4B)。MCF-7/ADM細(xì)胞在轉(zhuǎn)染NC后,P-gp表達(dá)為(83±12)%,轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物后,P-gp蛋白表達(dá)下降為(31±19)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。
2.4 轉(zhuǎn)染后卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞增殖的改變
2.4.1 轉(zhuǎn)染后卵巢癌A2780/Taxol和A2780細(xì)胞增殖的改變
MTT法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA27a 阻遏物后A2780/Taxol細(xì)胞存活率隨紫杉醇濃度的增加明顯降低,對紫杉醇的敏感性增加,IC50為0.53 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組(6.8 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖7A);轉(zhuǎn)染miRNA27a模擬物后A2780細(xì)胞對紫杉醇的敏感性下降,IC50為0.2 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組(0.06 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖7B)。
2.4.2 轉(zhuǎn)染后乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞增殖的改變
MTT法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物后MCF-7/ADM細(xì)胞存活率隨阿霉素濃度的增加明顯降低,對阿霉素的敏感性增加,IC50為4.61 μmol/L,與轉(zhuǎn)染NC組(26 μmol/L)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖8)。
圖4 P-gp在卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 4 Expression levels of P-gp in ovarian cancer and breast cancer cells
圖5 A2780/Taxol細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA27a阻遏物、模擬物及NC后的P-gp的表達(dá)Fig. 5 Expression of P-gp in A2780/Taxol cells transfected with mimics or inhibitors of miRNA27a or NC
圖6 MCF-7/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物及NC后P-gp的表達(dá)Fig. 6 Expression of P-gp in MCF-7/ADM cells transfected with mimics of miRNA451 or NC
圖7 轉(zhuǎn)染后A2780/Taxol和A2780細(xì)胞對紫杉醇敏感性的改變Fig. 7 Effects of miRNA27a on sensitivity of A2780/Taxol and A2780 cells to paclitaxel
圖8 轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADM細(xì)胞對阿霉素耐藥性的改變Fig. 8 Effects of miRNA451 on sensitivity of MCF-7/ADM cells to adriamycin
惡性腫瘤的耐藥是影響腫瘤化療成功的重要障礙,其耐藥的具體機(jī)制還不十分清楚,可能包括以下因素:①ABC型膜載體蛋白表達(dá)增高,ABC家族成員包括P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥蛋白等;②p53基因突變,p53蛋白具有抑制DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用,突變的p53基因還可以選擇性上調(diào)MDR1基因的表達(dá);③細(xì)胞凋亡通路受阻,如Bcl-2凋亡抑制基因表達(dá)增強(qiáng),腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制;④DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)失調(diào)等[10-11]。其中,P-gp是Biedler于1970年發(fā)現(xiàn),Juliano于1976年首次命名,是由MDR1基因編碼的分子量為170 KD的糖蛋白,具有藥泵功能,當(dāng)藥物進(jìn)入細(xì)胞后,與P-gp結(jié)合,同時(shí)P-gp的ATP位點(diǎn)結(jié)合ATP后釋放能量將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外,降低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度,P-gp對藥物的特異性較小,能夠?qū)⒍喾N結(jié)構(gòu)和機(jī)制不同的抗腫瘤藥物如紫杉醇、阿霉素和長春新堿等排出細(xì)胞外,使腫瘤細(xì)胞逃逸化療藥物的毒殺作用,從而產(chǎn)生耐藥[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/ Taxol和乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM中均檢測到P-gp高表達(dá),而在卵巢癌和乳腺癌親本細(xì)胞A2780和MCF-7中均未檢測到P-gp的表達(dá)。現(xiàn)有的研究已證明,P-gp過表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制之一,是引起腫瘤細(xì)胞對紫杉醇和阿霉素耐藥的主要原因。而這兩種化療藥是目前臨床上抗惡性腫瘤的一線藥物,因此,對腫瘤耐藥細(xì)胞中P-gp調(diào)控的研究,為臨床克服耐藥,提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量,有極為重要的意義。
在本實(shí)驗(yàn)中,我們檢測了卵巢癌A2780/ Taxol和乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞及其親本細(xì)胞中miRNA27a和miRNA451的表達(dá),結(jié)果顯示,miRNA27a在A2780/Taxol細(xì)胞中高表達(dá),與A2780細(xì)胞相比,表達(dá)增高2.2倍。miRNA451在MCF-7/ADM細(xì)胞中低表達(dá),與MCF-7細(xì)胞相比,表達(dá)降低84%。miRNA27a和miRNA451分別在P-gp高表達(dá)的A2780/Taxol和MCF-7/ADM細(xì)胞中表達(dá)異常,可能與耐藥相關(guān)。
隨后,我們將miRNA27a 模擬物轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)其MDR1 mRNA明顯升高,細(xì)胞對紫杉醇的敏感性下降。而將miRNA27a抑制物轉(zhuǎn)染A2780/Taxol細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)A2780/Taxol細(xì)胞中MDR1基因和P-gp表達(dá)均下降,細(xì)胞對紫杉醇的敏感性增加,這一研究結(jié)果表明,抑制miRNA27a表達(dá)可以下調(diào)P-gp表達(dá)和功能,增強(qiáng)A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性,部分逆轉(zhuǎn)耐藥,也進(jìn)一步表明,miRNA27a可能通過直接作用某些下游靶基因,間接調(diào)控MDR1/P-gp表達(dá)和功能。同時(shí),我們將miRNA451模擬物轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞,48和72 h后分別檢測細(xì)胞中MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物后,MCF-7/ADM細(xì)胞的MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)明顯下降,這證明miRNA451負(fù)性調(diào)控P-gp的表達(dá),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)miRNA451表達(dá)下降時(shí),這種負(fù)性調(diào)控消失,P-gp表達(dá)增加。將miRNA451模擬物轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞,恢復(fù)miRNA451表達(dá)后,P-gp受到負(fù)性調(diào)控,表達(dá)下降。為了研究miRNA451與MCF-7/ADM細(xì)胞耐阿霉素的關(guān)系,將miRNA451模擬物轉(zhuǎn)染MCF-7/ADM細(xì)胞后,加入不同濃度的阿霉素后用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA451模擬物后細(xì)胞對阿霉素的敏感性增加,部分逆轉(zhuǎn)了耐藥。
綜上所述,miRNA27a和miRNA451分別在卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞A2780/Taxol和乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM中異常表達(dá),在抑制或恢復(fù)miRNA27a和miRNA451的表達(dá)后,可以部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥。miRNA27a和miRNA451可能分別通過間接或直接作用于MDR1/P-gp,參與腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生、發(fā)展,其具體調(diào)節(jié)過程有待進(jìn)一步研究。
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·更正聲明·
刊登于第25卷第1期上的《白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)合替吉奧治療吉西他濱治療失敗進(jìn)展期胰腺癌的臨床觀察》一文的通信作者原為彭小波,現(xiàn)更改為傅強(qiáng)。
本刊編輯部
Expressions of miRNA27a and miRNA451 in ovarian cancer and breast cancer cells and its correlation with drug resistance by targeting MDR1/P-glycoprotein
LI Zhimin1, LUO Xiping1, ZENG Liqin1, PENG Xiuhong1, WANG Yi1, WANG Zehua2(1.Department of Gynecology, Guangdong Women and Children Hospital, Guangzhou Guangdong 510010, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei 430022, China)
LUO Xiping E-mail: lilyzhimin@sina.com
Ovarian cancer; Breast cancer; Paclitaxel; Doxorubicin; MicroRNA; Drug resistance
]Background and purpose:Resistance of cancer cells to chemotherapy is a major clinical obstacle to successful treatment and leads to poor prognosis for the patients. MicroRNA (miRNA) plays a vital role in tumor cells response to chemotherapeutic agents. This study plans to investigate the expressions of miRNA27a and miRNA451 in ovarian cancer and breast cancer cells and its correlation with drug resistance.Methods:A2780/Taxol cells were established using stepwise selection; Stem-loop quantitative real-time PCR (stem-loop RT-PCR) was used to detect expression of miRNA27a and miRNA451 in ovarian cancer and breast cancer cells. The A2780 and A2780/Taxol cells were transfected with the mimics or inhibitors of miRNA27a or negative control (NC) RNA and the mimics of miRNA451 or NC were transfected into MCF-7/ADM cells by LipofectamineTM2000. The expression levels of MDR1 mRNA and P-glycoprotein (P-gp) were examined using RT-PCR and Western blot respectively. MTT method was used to analyze drug sensitivity.Results:The expression of miRNA27a was an average of (2.2±0.30) times higher in A2780/ Taxol cells than in A2780 cells, with a significant difference between the two groups (P<0.05). The expression of miRNA451 was lower by 84% in MCF-7/ADM cells than in MCF-7 cells, with a signifcant difference between the two groups (P<0.05). A2780/Taxol cells transfection with inhibitors of miRNA27a showed that the levels of MDR1 mRNA was decreased by (39±0.14)%, P-gp level [(26±5.3)%] decreased compared with the NC group [(43±6.7)%], the IC50(0.53 μmol/L) was less than the NC group (6.8 μmol/L), and there was a signifcant difference between two groups (P<0.05). Transfection of A2780 cells with mimics of miRNA27a led to increase MDR1 mRNA expression by (121±0.11)% and decrease the sensitivity to paclitaxel (IC50: 0.2 μmol/L vs 0.06 μmol/L). There was a signifcant difference between two groups (P<0.05). Transfection of MCF-7/ADM cells with mimics of miRNA451 showed that expression of MDR1 mRNA was decreased by (65±12)%, P-gp [(31±19)%] was less than the NC group [(83±12)%], the sensitivity of cells to adriamycin enhanced and the IC50of adriamycin (4.61 μmol/L) was less than the NC group (26 μmol/L), and there was a signifcant difference between two groups (P<0.05).Conclusion:The expressions of miRNA27a and miRNA451 are deregulated in A2780/Taxol and MCF-7/ADM cells respectively, which may play vital roles in drug resistance by regulating MDR1/P-gp expression directly or indirectly.
2014-05-13
2014-08-13)
羅喜平 E-mail:lilyzhimin@sina.com
10.3969/j.issn.1007-3969.2015.03.006
R737.31;R737.9
A
1007-3639(2015)03-0190-09
[