李媛媛，王紅艷，吳曉燕，宋瑞卉，李敬

1.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

3.山東省高校免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053；

4.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053

顆粒蛋白前體調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖與衰老的效應(yīng)研究

李媛媛1，王紅艷2,3，吳曉燕2，宋瑞卉1，李敬4

1.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

3.山東省高校免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊261053；

4.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053

背景與目的：顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種新型生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期進(jìn)展及腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用。PGRN在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，不僅參與腫瘤的生長(zhǎng)過程，還與腫瘤的發(fā)生、演變過程關(guān)系密切。本研究旨在探討PGRN在胃癌組織中的表達(dá)，及其對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞增殖與衰老的影響。方法：利用免疫組化方法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中PGRN的表達(dá)；利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)干擾胃癌細(xì)胞株BGC823中PGRN的表達(dá)；通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞衰老檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，探討PGRN對(duì)BGC823細(xì)胞增殖與衰老的影響。結(jié)果：PGRN在胃癌組織中高表達(dá)。PGRN表達(dá)降低后，胃癌細(xì)胞的增殖與克隆形成能力均顯著降低。PGRN-siRNA細(xì)胞的克隆形成率為(25.3±3.1)%，對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成率為(72.1±5.7)%，正常組細(xì)胞的克隆形成率為(80.3±4.0)%。兩兩比較，對(duì)照組與正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。干擾PGRN表達(dá)能夠明顯促進(jìn)BGC823細(xì)胞衰老。PGRN-siRNA細(xì)胞衰老陽性率為(27.6±2.1)%，對(duì)照組細(xì)胞衰老陽性率為(3.2±1.3)%，正常組細(xì)胞衰老陽性率為(1.9±1.2)%。兩兩比較，對(duì)照組與正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。結(jié)論：PGRN可作為新的胃癌標(biāo)志物，為臨床胃癌的靶向治療提供新的思路。

胃腫瘤；顆粒蛋白前體；siRNA；細(xì)胞衰老

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，發(fā)病率高且預(yù)后差。近年來隨著人們對(duì)惡性腫瘤病因及發(fā)病機(jī)制等方面的研究，胃癌和其他惡性腫瘤一樣被認(rèn)為是一種基因性疾病，胃癌的發(fā)生、演變與多種癌基因的異常表達(dá)有關(guān)［1-2］。因此，研究胃癌相關(guān)基因?qū)τ诮沂疚赴┑陌l(fā)病機(jī)制與探討有效的防治方法具有重要意義。

顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種獨(dú)立的、新型生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)大部分組織和器官中表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及修復(fù)損傷等過程起著重要作用。目前，多項(xiàng)研究表明，PGRN在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如宮頸癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等［3-5］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過降低PGRN mRNA的表達(dá)可以明顯降低腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)［6］，然而關(guān)于PGRN在胃癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義鮮有報(bào)道。

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞處于不可逆的周期停滯狀態(tài)，但在相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)依然保持代謝活性，典型特征是β-半乳糖苷酶染色呈陽性。本研究通過檢測(cè)PGRN在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與衰老的影響，為胃癌的臨床靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

臨床標(biāo)本取自濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)切除的胃癌及癌旁組織各50例，標(biāo)本均經(jīng)病理確診。

1.2 材料和試劑

山羊抗人PGRN單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectimineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，PCR試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，衰老檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。PGRN siRNA序列5’-r(GGCCACUCCUGCAUCUUUA)dTdT-3’及對(duì)照組siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。PGRN引物順義鏈：5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’；反義鏈：5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’。內(nèi)參β-actin引物順義鏈：5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’；反義鏈：5’-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化

胃癌及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、包埋處理后切片，按照PGRN檢測(cè)試劑盒說明書，采用山羊超敏二步法進(jìn)行免疫組化染色，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判斷：以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為PGRN陽性表達(dá)，高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)PGRN陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)其平均數(shù)求PGRN陽性表達(dá)率。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株BGC823置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640。

1.3.3 siRNA轉(zhuǎn)染［7］及轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。步驟如下：每孔取5 μL siRNA溶于250 μL OPTI-MEM中，混勻常溫放置5 min；取5 μL LipofectamineTM2000溶于250 μL OPTI-MEM中，混勻常溫放置5 min；然后將兩種混合液混勻，常溫放置15 min，加入培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)72 h。轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別為對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞。

1.3.4 利用qRT-PCR檢測(cè)RNA干擾效果

收集正常細(xì)胞、對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，具體步驟按說明書進(jìn)行操作，提取完測(cè)定濃度，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?；利用提取的RNA合成cDNA；用qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃6 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外透射儀觀察。

1.3.5 BGC823細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

將正常細(xì)胞組、對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)72 h；加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO室溫?fù)u床震蕩10 min，檢測(cè)570 nm吸光度(D)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 BGC823細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)［8］

將正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h；無菌PBS沖洗，胰酶消化，將細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋，計(jì)數(shù)；取300個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，分散均勻，各做3復(fù)孔；放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)；吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，每孔加入500 μL甲醇固定5 min；吸出固定液，PBS洗滌，加適量吉姆薩染液染色10 min；PBS洗滌、干燥，低倍鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.7 BGC823細(xì)胞衰老檢測(cè)［9］

應(yīng)用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法，步驟如下：將正常、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h；吸出6孔板中的培養(yǎng)基，PBS洗滌1次；每孔加入固定液1 mL，室溫固定15 min；再吸出固定液，PBS洗滌3次；吸出PBS，每孔加入1 mL現(xiàn)配置的染色工作液；保鮮膜封住培養(yǎng)板，在37 ℃普通溫箱中溫育過夜；光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞所占細(xì)胞百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異采用χ2或t檢驗(yàn)，多樣本間比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PGRN在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織

通過免疫組化染色方法檢測(cè)PGRN在胃癌及癌旁胃黏膜組織標(biāo)本中的表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果顯示，在50例癌旁胃黏膜標(biāo)本中，PGRN陽性表達(dá)率為16.7%，在50例胃癌標(biāo)本中，PGRN陽性表達(dá)率為87.4%。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.2 抑制PGRN表達(dá)導(dǎo)致BGC823細(xì)胞增殖能力與克隆形成能力均降低

通過干擾BGC823細(xì)胞PGRN后，利用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定PGRN對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PGRN-siRNA細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞和正常細(xì)胞組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PGRN mRNA明顯低于其他兩組，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，PGRN受到抑制的BGC823細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力均顯著降低，克隆形成數(shù)目減少，體積減小。PGRN-siRNA細(xì)胞的克隆形成率為(25.3±3.1)%，對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成率為(72.1±5.7)%，正常組細(xì)胞的克隆形成率為(80.3±4.0)%。兩兩比較，對(duì)照組與正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與其他兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，圖2、3)。

2.3 抑制PGRN表達(dá)導(dǎo)致BGC823細(xì)胞衰老程度增加

SA-β-gal是一種細(xì)胞衰老標(biāo)志物，細(xì)胞老化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生綠色沉淀。應(yīng)用SA-β-gal染色，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞衰老程度和數(shù)量明顯增加，衰老陽性率為(27.6±2.1)%，對(duì)照組細(xì)胞衰老陽性率為(3.2±1.3)%，正常組細(xì)胞衰老陽性率為(1.9±1.2)%。兩兩比較，對(duì)照組與正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，圖4)。 (DAB, ×100)

圖1 PGRN在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig. 1 Expression of PGRN in adjacent normal and cancerous gastric tissues

圖2 干擾PGRN表達(dá)對(duì)BGC823細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 2 Morphology changes with siRNA and control in BGC823 cells

圖3 干擾PGRN表達(dá)致BGC823細(xì)胞增殖和克隆形成減少Fig. 3 Inhibition of PGRN in BGC823 cells decreased the proliferation and clonogenic capacity

圖4 干擾PGRN表達(dá)致BGC823細(xì)胞衰老程度增加Fig. 4 Inhibition of PGRN in BGC823 cells promoted senescence

3 討 論

胃癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，病死率高，目前胃癌的發(fā)生機(jī)制仍不明確，尚無有效針對(duì)胃癌的治療手段。因此，探索新型的治療途徑，找到有效的治療方法勢(shì)在必行。

近年來，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的許多標(biāo)志物被逐漸認(rèn)識(shí)。PGRN就是一種新型、分泌性生長(zhǎng)因子，除在機(jī)體中調(diào)節(jié)各種上皮細(xì)胞的增殖外，還和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及預(yù)后息息相關(guān)。Pizarro等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PGRN能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成與腫瘤細(xì)胞的侵襲。Han等［11］認(rèn)為，PGRN可作為一個(gè)獨(dú)立的晚期卵巢上皮細(xì)胞癌預(yù)后標(biāo)志物，這與Carlson等［12］的研究結(jié)果一致。Carlson等［12］曾報(bào)道在卵巢上皮細(xì)胞癌患者中，越高的PGRN導(dǎo)致患者的生存率越低。目前，對(duì)于PGRN作用機(jī)制的研究還非常少。Frampton等［13］認(rèn)為，PGRN是通過介導(dǎo)去乙?；?(sirtuin1，SIRT1)導(dǎo)致膽管增生和膽管癌細(xì)胞過度增殖。Swamydas等［14］則認(rèn)為是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)激活PGRN引起ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲。然而關(guān)于PGRN在胃癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義卻極少報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在胃癌組織和胃癌細(xì)胞BGC823中亦存在高表達(dá)，通過siRNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞中PGRN的表達(dá)，PGRN-siRNA細(xì)胞與正常細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞比較，PGRN-siRNA細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞變的大而平，細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯增多，對(duì)照組細(xì)胞未見明顯改變，細(xì)胞輪廓清晰、生長(zhǎng)良好。通過檢測(cè)細(xì)胞的增殖與克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)干擾PGRN表達(dá)后的BGC823細(xì)胞的增殖能力與克隆形成能力明顯降低，說明PGRN與胃癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。為探討PGRN對(duì)BGC823細(xì)胞增殖影響的原因，本研究采用SA-β-gal染色法進(jìn)一步檢測(cè)。SA-β-gal是一種細(xì)胞衰老標(biāo)志物，細(xì)胞衰老被認(rèn)為是一種程序性的細(xì)胞反應(yīng)，使細(xì)胞不可逆的分裂停滯。近年來的研究顯示，細(xì)胞衰老是一種抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要方式［15］。細(xì)胞衰老可抑制腫瘤惡變，還可以增強(qiáng)化療藥物及腫瘤治療的療效［16-17］。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和正常組細(xì)胞比較，衰老細(xì)胞程度和數(shù)量顯著增加，表明PGRN是BGC823細(xì)胞衰老過程中的重要調(diào)控因子，在BGC823細(xì)胞衰老發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，通過衰老途徑可以影響胃癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)前人們對(duì)細(xì)胞的衰老機(jī)制，以及細(xì)胞衰老在惡性腫瘤發(fā)生過程中的作用了解還很少，仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，惡性腫瘤高表達(dá)PGRN與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和低生存率密切相關(guān)。PGRN可能是一個(gè)新的生物標(biāo)志物，是臨床胃癌治療的新的靶向目標(biāo)，對(duì)今后胃癌的診斷和臨床治療具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Effects of progranulin on proliferation and senescence in gastric cancer cells

LI Yuanyuan1, WANG Hongyan2,3, WU Xiaoyan2, SONG Ruihui1, LI Jing4 (1.Department of Morphology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 2.Department of Microbiology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 3.Key Lab for Immunology in Universities of Shandong Province, Weifang Shandong 261053, China; 4.Basic Medical College, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China)

WANG Hongyan E-mail: sdwfwhy@163.com

Background and purpose:Progranulin (PGRN) is a novel growth factor that plays an important role in the tumorigenicity, tumor cell migration and cell cycle. Its expression in many malignant tumor cells is high. It is not only involved in tumor cell growth, but also closely related with the occurrence and evolution of tumor. This study was to investigate the expression of PGRN in gastric cancer and the effects on proliferation and senescence in gastric cancer cell line BGC823.Methods:Immunohistochemical method was used to detect the expression of PGRN in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues; Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of PGRN in PGRN-siRNA BGC823 cells; MTT method, cell colony formation and cell senescence experiments were used to explore the effects of PGRN on proliferation and senescence in BGC823cell.Results:PGRN protein levels were high in gastric cancer tissues; Knocking down the PGRN gene in BGC823 decreased the proliferation and clonogenic capacity, cloning effciency in PGRN-siRNA group was (25.3±3.1)%, in the control group was (72.1±5.7)%, and in the normal cells was (80.3±4.0)%, there was no signifcant difference between normal group and control group, but there were signifcant differences among PGRN-siRNA group and the other two groups (P＜0.05); Knocking down the PGRN gene in BGC823 cells could promote cell senescence. The positive rate of aging in PGRN-siRNA group was (27.6±2.1)%, in the control group was (3.2±1.3)%, and in the normal group was (1.9±1.2)%, there was no signifcant difference between normal group and control group. But there were signifcant differences among PGRN-siRNA group and the other two groups (P＜0.05).Conclusion:PGRN can be used as a new marker for gastric cancer, and provide new ideas to the treatment of gastric cancer.

Gastric neoplasms; Progranulin; siRNA; Cell senescence

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.03.003

R735.2

A

1007-3639(2015)03-0173-06

2014-08-07

2014-11-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201262)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011HZ114)。

王紅艷 E-mail:sdwfwhy@163.com