李榮，郭源平，潘敬新，郭奕斌

1. 中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，廣州 510080；2. 中山大學醫(yī)學遺傳室業(yè)余科研小組/廣州市第十六中學高二(3)班，廣州 510080；3. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)科，泉州 362000

成骨不全Ⅰ型家系的基因檢測和COL1A2基因新突變的致病性鑒定

李榮1，郭源平2，潘敬新3，郭奕斌1

1. 中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，廣州 510080；2. 中山大學醫(yī)學遺傳室業(yè)余科研小組/廣州市第十六中學高二(3)班，廣州 510080；3. 福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)科，泉州 362000

為了揭示成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI)Ⅰ型家系的分子遺傳學發(fā)生機制，文章采用PCR-DNA直接測序法，對患兒COL1A1和COL1A2基因共103個外顯子(E)進行突變檢測。結(jié)果顯示：患兒COL1A1基因未發(fā)現(xiàn)任何病理性突變，而在COL1A2基因E19內(nèi)發(fā)現(xiàn)一新的雜合錯義突變(p.G316C)，該突變來自其父，而其母正常，其他表型正常的 6位親屬也均未發(fā)現(xiàn)該突變；通過 DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography)篩檢，發(fā)現(xiàn)患兒與其父均有異常雙峰，而其母和所有正常對照均為正常單峰；通過ASA(Allele specific amplification)篩檢，患兒與其父均有391 bp的特異擴增帶，而其母和所有正常對照均未見特異擴增帶；保守性分析結(jié)果顯示，該突變位點所在甘氨酸在進化上具有高度保守性；SIFT和PolyPhen-2軟件預測結(jié)果顯示，新突變造成的結(jié)果是“有害的”和“很可能有害”。上述結(jié)果均說明 COL1A2基因c.946G>T/p.G316C新突變是導致OI-Ⅰ型的致病性突變，是引起患兒發(fā)病的真正內(nèi)因?；純焊改溉粼俅卧杏?，可在孕早期進行產(chǎn)前基因診斷或孕前期進行PGD(Preimplantation genetic diagnosis)予以防患。

成骨不全Ⅰ型；C0L1A2基因；新突變；致病性鑒定

成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI)又稱為脆骨病，是一種全身結(jié)締組織遺傳病，常見的、經(jīng)典的 OI呈常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant, AD)，而罕見的、新發(fā)現(xiàn)的呈常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive, AR)[1～3]。該病臨床特征主要表現(xiàn)為不同程度的骨折、骨畸形、骨脆性增加、藍鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、聽力下降等[4,5]。據(jù)統(tǒng)計，成骨不全在國外的發(fā)病率為 1/30000～1/10000[4]，而在中國人群中的發(fā)病率約為4/10000[5]。根據(jù)最新文獻報道，成骨不全可分為Ⅰ～ⅩⅤ型(表1)。其中，成骨不全Ⅰ型(OI-Ⅰ, MIM 166200)最為常見，但癥狀相對較輕，主要表現(xiàn)為輕度的身材矮小，輕度到中度的骨裂，骨質(zhì)疏松，骨密度下降，易反復骨折而引起多處畸形，關(guān)節(jié)松弛以及藍鞏膜等。OI-Ⅰ為 AD遺傳，表現(xiàn)度有差異，有的表現(xiàn)為反復骨折，有的僅表現(xiàn)為骨裂，群體發(fā)病率約 1/3萬活嬰。本病是由Ⅰ型膠原蛋白基因突變所致，Ⅰ型膠原是由2條α1鏈和1條α2鏈組成，分別由COL1A1基因和COL1A2基因編碼，其中COL1A1基因位于染色體17q21.31～q22.05，全長18 kb，有51個外顯子，COL1A2基因位于染色體7q22.1，全長38 kb，有52個外顯子[6]。

成骨不全至今仍無切實有效的根治手段，因此，檢出突變、對新突變進行鑒定、闡明病因、對再次妊娠的高危胎兒實施產(chǎn)前基因診斷是目前防治該病的最佳應對策略和優(yōu)生手段，而闡明其分子遺傳學發(fā)生機制也是開展孕早期診斷和胚胎植入前診斷的必要前提條件。

本研究對一疑似成骨不全Ⅰ型的家系進行了COL1A1、COL1A2基因診斷，發(fā)現(xiàn)COL1A2基因存在一新的錯義突變，并對該新突變進行了詳細的致病性鑒定。

表1 成骨不全分型列表

1 對象與方法

1.1 研究對象

先證者：女，漢族，就診時9歲7個月，2014 年4月因骨骼畸形及大腿骨折復發(fā)，經(jīng)外院轉(zhuǎn)診到我室進行基因診斷，以便為其父母再孕時的產(chǎn)前基因診斷做準備。據(jù)述，患兒從小就有反復骨折病史，1歲7個月時就因外傷發(fā)生過骨折。2歲1個月時復診：右下肢不愿活動，動之哭鬧加劇，拍片示右股骨下段青枝骨折。2歲11個月復診：右股骨骨干細小，向外彎曲畸形，見多個新舊之骨折，對位尚好，右膝諸骨骨質(zhì)疏松。診斷意見：上述骨質(zhì)改變考慮成骨不全。4歲11個月因右下肢彎曲短縮畸形、跛行2年多入院檢查。X光片顯示：右側(cè)股骨彎曲畸形為成骨不全改變，原病理骨折已愈合。膝關(guān)節(jié)及脛骨骨骺骨質(zhì)疏松。診斷：成骨不全癥；右股骨陳舊性骨折并彎曲畸形。5歲 8個月因右大腿彎曲畸形，術(shù)后9個月復查，結(jié)論同4歲11個月。7歲1個月入院檢查，X光片所見：左股骨中段骨折，骨痂較前增多，較明顯。成骨不全改變，同前。左股骨下端外側(cè)干骺端密度增高硬化。8歲2個月因“跌倒致傷左大腿腫痛活動受限1 d”入院檢查，大腿中上段中度腫脹，壓痛敏銳，縱叩痛(+)，骨干力喪失，捫及骨擦感及異?；顒樱リP(guān)節(jié)活動受限，足背動脈搏動可觸及，趾動，血運好。診斷：左股骨上段骨折；成骨不全。

先證者父親：小時未發(fā)生骨折，但在12～13歲時，因騎車摔倒等外傷曾發(fā)生過多次骨裂，骨裂部位發(fā)生在雙手的前臂，也發(fā)生在雙下肢的小腿，但癥狀較輕，發(fā)病年齡也比其女兒晚。根據(jù)上述臨床資料，擬診為成骨不全Ⅰ型，詳細病因及分型待基因檢測確診。

正常對照組：為我室近3年來收集的、來自南方地區(qū)的、無親緣關(guān)系的、表型正常的健康個體共150名。其中男80名，年齡24～32歲；女70名，年齡22～28歲。另外，還收集了先證者家族中表型正常的部分親屬共6人，其中男、女各3人。

本研究已得到中山大學中山醫(yī)學院倫理委員會批準，患兒及其父母完全知情并簽署“基因診斷知情同意書”。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA模板的制備

抽取先證患兒、患兒父母及正常對照組的外周血各2～4 mL(1～2管)，EDTA抗凝。參考文獻[7]的方法或全血DNA提取試劑盒(Sigma公司)制備模板DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增及測序

普通引物的擴增：參照文獻[8,9]設(shè)計 COL1A1 和COL1A2基因的擴增引物，引物由上海美吉公司或北京中美泰和公司合成。COL1A1基因擴增條件參照文獻[10,11]。COL1A2基因擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30s，55～65℃復性40 s，72℃延伸45s，38個循環(huán)；最后再72℃延伸10 min，4℃保存或直接電泳。擴增體系(30 μL)：10×Buffer 3 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2.8 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 20 μL，rTaq 酶0.2 μL(試劑盒購自TaKaRa公司)。

為了保證建筑物平面尺寸和各層標高的正確，砌筑前應認真做好抄平、放線工作，砌磚時必須跟線走。鋪灰不能半邊厚、半邊薄，以免造成磚面傾斜，砌筑時應做到“三層一吊，五層一靠”。

COL1A2基因E19(c.946)特異引物的擴增：根據(jù)等位基因特異性擴增(Allele-specific amplification, ASA)，即擴增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification refractory mutation system, ARMS)原理，針對新突變位點c.946G> T，采用Primer premier 5.0軟件，設(shè)計一對單堿基錯配特異引物。上游引物：5′- CCGCCGGTCCCCGTGGTGAAG-3′，下游引物：5′-GCCGGGAGCCCCAGCAACGCA-3′。擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30s，68℃復性40 s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。擴增體系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL(試劑盒購自北京康潤生物公司)。用 1.2%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為了驗證錯配的堿基是否與設(shè)計的一致，PCR擴增后將產(chǎn)物送測序公司進行測序。普通引物和特異引物的擴增產(chǎn)物，根據(jù)需要進行正向或反向或雙向測序。

1.2.3 新突變的致病性鑒定

對 HGMD數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database, 2014, http://www.hgmd.org/)、NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和近5年的文獻進行檢索，證實先證患兒所攜帶的COL1A2基因c.946G>T/p.G316C突變是一新的突變類型，故需對其致病性進行詳細鑒定，以闡明患兒發(fā)病的真正內(nèi)因。鑒定步驟包括：(1)采用DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography)法對由患兒和其父組成的實驗組以及由其母和 150名健康人組成的正常對照組進行突變篩查，以統(tǒng)計該突變在群體中的發(fā)生頻率，從而確認或排除多態(tài)性的可能；(2)采用 ASA(Allele specific amplification)法直接將實驗組和對照組樣品同時擴增，通過觀察擴增結(jié)果，來鑒定待檢樣品是否存在突變，然后統(tǒng)計、確認或排除多態(tài)性的可能；(3)利用Clustal X軟件，對人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、獼猴(Macaca mulatta)、原雞(Gallus gallus)、非洲爪蟾(Xenopus)、斑馬魚(Danio rerio)、葉吻銀鮫(Callorhinchus milii)等13個物種該位點的氨基酸進行保守性分析，根據(jù)保守性的強弱來判斷突變致病性的大?。?4)利用SIFT和PolyPhen軟件對突變的危害性進行預測，以此判斷該突變的致病性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及測序

利用COL1A2基因E19普通引物對正常對照、患兒父親、患兒母親、先證患兒進行PCR擴增，結(jié)果顯示：4個樣品均有372 bp的擴增產(chǎn)物(圖略)，這與預期結(jié)果完全相符。

測序結(jié)果表明，患兒COL1A1基因51個外顯子均未檢出病理性突變，但在COL1A2基因第19外顯子的編碼區(qū)內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)一雜合錯義新突變(c.946G>T)，為G/T雜合峰形(圖1D)。將患兒父母和正常對照的E19同時測序，然后用 Chromas軟件進行比對，發(fā)現(xiàn)患兒突變來自其父(圖1B)，而其母正常(圖1C)。

圖 1 正常對照(N)、患兒父親(F)、患兒母親(M)、先證患兒(P)的COL1A2 E19正向序列比對圖

2.2 新突變的致病性鑒定結(jié)果

2.2.1 COL1A2 E19的DHPLC篩檢結(jié)果

圖2 COL1A2 E19的DHPLC篩檢結(jié)果

2.2.2 COL1A2 E19 的ASA篩檢結(jié)果

COL1A2 E19特異引物的擴增產(chǎn)物為391 bp?；純焊赣H與患兒均擴增陽性(圖3的泳道2和4)，而母親為陰性(圖3的泳道3)，2例正常對照也全為陰性(圖3的泳道1和5)。另外，隨機選取的148例正常對照擴增也均為陰性。這與本文預期的結(jié)果完全一致，說明正常組不含有c.946G>T突變，從而說明該突變不是一般的多態(tài)性變異，而是一種新的致病性突變。

圖3 COL1A2 E19特異引物的擴增產(chǎn)物

2.2.3 COL1A2 E19單錯配特異引物的驗證結(jié)果

突變點的堿基與本文設(shè)計時引入的單錯配堿基(把正常的 G錯配為 T)完全一致，進一步驗證了產(chǎn)物的準確性、鑒定的可行性(圖4，C和D)。正常的純合G由于無法與錯配堿基T配對，故擴增陰性，而雜合子既含有 G，也含有 T，所以有一條模板鏈擴增陽性，故有擴增產(chǎn)物。C和D分別是患兒父親和先證患兒，其c.946均為T純合子(三劃線所示)。

圖4 COL1A2 E19普通引物和特異引物擴增產(chǎn)物的測序比較結(jié)果

2.2.4 突變位點氨基酸的保守性分析結(jié)果

COL1A2肽鏈即α2鏈第316位氨基酸即新突變所在位置，在13個不同來源的跨物種中均為甘氨酸(G)(圖5紅框所示部位)，說明該位點在進化過程中高度保守，也說明這個氨基酸具有重要的生化功能。因此，該位點一旦發(fā)生突變，勢必影響Ⅰ型膠原α2鏈的氨基酸組成，影響其螺旋結(jié)構(gòu)，進而影響其正常功能，最終導致OI-Ⅰ型的發(fā)生。由此可以推斷，這個新突變很可能就是致病性突變。

2.2.5 SIFT和PolyPhen-2軟件對突變危害性的預測結(jié)果

SIFT軟件預測結(jié)果為“有害的”，如圖 6藍框所示部位。PolyPhen-2預測結(jié)果為“很可能有害”(圖略)?？梢妏.316位的甘氨酸被半胱氨酸替代是有害的，因而進一步證實p.G316C突變是一種新的致病性突變。

圖5 p316甘氨酸(G)在13個跨物種中的保守性分析結(jié)果

圖6 SIFT軟件預測結(jié)果

3 討 論

成骨不全(OI)類型多，癥狀大多相似，臨床診斷只能初診而無法確診和分型，更無法在孕早期進行產(chǎn)前診斷。而基因診斷不但可以確診，而且可以用于產(chǎn)前/植入前診斷。OI-Ⅰ型是由于COL1A1基因或COL1A2基因發(fā)生突變所致，所以找到病理性突變是確診的關(guān)鍵。本文通過對先證者的 COL1A1、COL1A2基因進行詳細的檢測，COL1A1基因未發(fā)現(xiàn)任何病理性突變，但在COL1A2 E19的編碼區(qū)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)一個雜合錯義突變(p.G316C)。這兩個基因都具有高度遺傳異質(zhì)性，不但種類多(截至本文發(fā)稿之時已報近千種，其中，COL1A1基因的突變種類有614種，COL1A2的有357種(http://www.hgmd.cf.ac. uk/ac/index.php))，而且突變類型也多種多樣。不同的突變類型，其表型效應也不同，甚至大相徑庭。對于單堿基置換引起的錯義突變，情況更為復雜，病因更難確定。因此，對于新發(fā)現(xiàn)的未知突變，必須對其致病性進行詳細鑒定，方能闡明發(fā)病的真正原因，才能為今后的產(chǎn)前乃至植入前診斷創(chuàng)造前提條件。本文先證患兒的父母7、8年來一直不敢再孕就是因為基因水平的病因一直未明的緣故。

對于新突變的致病性鑒定，目前比較常用、比較可行的方法主要有：突變頻率的統(tǒng)計；突變點氨基酸的保守性分析；生物信息學軟件對突變危害性的預測；正常蛋白與突變蛋白高級結(jié)構(gòu)的比對。此外，還可進行RNA水平、蛋白水平的鑒定，如果是遺傳性代謝病，還可進行酶學鑒定。對于群體突變頻率的統(tǒng)計，主要是用于排除SNP的可能。雖然統(tǒng)計方法不少，但由于樣品量大、費用高，故需采用快速特異、簡便廉價、高通量的技術(shù)。DHPLC、ASA法正好可以滿足這些條件，它們可以在短短幾天之內(nèi)完成對數(shù)百例樣品的篩檢，既快速特異，又容易操作，而且成本也較低。

關(guān)于RNA水平、蛋白水平的鑒定，由于COL1A1、COL1A2基因都不在外周血表達或表達極少，而主要在皮膚、骨髓、脂肪細胞、PB-CD4+T細胞、胸腺、扁桃腺、腦、睪丸、卵巢、肝、腎、肺、心臟、胰島等組織表達(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear? org=human)，而取皮膚、骨髓等組織均為有創(chuàng)性檢查，加上OI病會導致患兒血小板明顯減少，故很難征得患兒父母的同意，所以很難在RNA水平和蛋白水平進行更深入地鑒定。

關(guān)于COL1A1、COL1A2基因突變的分子致病機制目前主要有兩種：一是雜合無義突變、移碼突變和剪切位點改變導致了COL1A1基因單倍劑量不足，它是引起OI-Ⅰ型的主要致病機理。因為這些突變會導致mRNA的不穩(wěn)定，導致約50%的Ⅰ型膠原的合成減少[12]；二是COL1A1、COL1A2基因突變引起甘氨酸的替代，導致 α鏈不能正確合成，導致Ⅰ型膠原分子的結(jié)構(gòu)異常，從而影響到整個膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，最終引起疾病的發(fā)生。而表型的多樣性可能與Ⅰ型膠原螺旋結(jié)構(gòu)的破壞程度和聚集位點在蛋白質(zhì)相互作用的重要性有關(guān)[12]，因為Ⅰ型膠原的三膠螺旋區(qū)都含有338個連續(xù)重復的Gly-X-Y三螺旋結(jié)構(gòu)，甘氨酸的存在對三螺旋的形成至關(guān)重要[13]。

COL1A1和 COL1A2基因突變導致的甘氨酸替換會引起Ⅰ型膠原三級螺旋結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定[12]，發(fā)生在Ⅰ型膠原α1鏈上的甘氨酸的替換通常是致死的，而由COL1A2基因突變引起的甘氨酸的替換則通常是不致死的[14]。本文所發(fā)現(xiàn)的新突變(c.946G>T, p.G316C)，導致了α2鏈上甘氨酸(G)被半胱氨酸(C)替代，其臨床癥狀較輕也印證了這一點。Gentile等[15]報道，COL1A2基因c.946G>A突變(p.G316S，“甘氨酸”被“絲氨酸”替代)會引起 OI-Ⅰ型(臨床癥狀僅表現(xiàn)為輕度畸形或無畸形)；Marini等[14]報道，COL1A2基因c.946G>C突變(p.G316R，“甘氨酸”被“精氨酸”替代)則引起OI-Ⅲ型(臨床表現(xiàn)為骨骼嚴重畸形)，可見相同位點被不同氨基酸替代有可能產(chǎn)生不同的表型，而相同氨基酸在同一位置替換在不同的個體中也會有不同的表型，本文中先證患女的癥狀較其父親嚴重也印證了這一點。G316S和G316R錯義突變之所以會出現(xiàn)表型的明顯差異，很可能是因為絲氨酸S的化學結(jié)構(gòu)、所帶電荷數(shù)和等電點(Ser 的pI=5.68)跟甘氨酸G的差別不大(Gly的pI=5.97)，故對第 316位氨基酸所形成的立體空間構(gòu)象影響不大，故只表現(xiàn)為較輕的Ⅰ型；而精氨酸R正好相反，它是一種堿性氨基酸，其化學結(jié)構(gòu)、官能團、所帶電荷數(shù)和等電點(Arg的pI=10.76)等都跟甘氨酸有明顯差別，故突變后會造成第316位氨基酸所形成的空間構(gòu)象發(fā)生明顯改變，進而影響到膠原蛋白α2鏈的正常結(jié)構(gòu)和功能以及與α1鏈的相互結(jié)合，導致Ⅰ型膠原蛋白合成受阻，繼而導致成骨組織合成出現(xiàn)明顯障礙，最終導致OI-Ⅲ型的發(fā)生。本文所發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸，其化學性質(zhì)和絲氨酸很相似，都是極性中性氨基酸，其化學結(jié)構(gòu)、所帶電荷數(shù)和等電點(Cys 的 pI=5.05)和甘氨酸的差別也不大，所以也只產(chǎn)生Ⅰ型表型(從本文所研究的對象來看，p.G316C新突變所導致的表型效應符合OI-Ⅰ型的臨床表現(xiàn))。

由于OI-Ⅰ型臨床癥狀較輕，故在臨床上容易出現(xiàn)誤診和漏診，此時基因診斷對該病的確診至關(guān)重要。本研究一方面揭示了患兒發(fā)病的分子遺傳學機制，另一方面進一步豐富了 HGMD突變數(shù)據(jù)庫的COL1A2基因突變類型，更重要的是為患兒父母今后的早期產(chǎn)前診斷乃至胚胎植入前基因診斷創(chuàng)造了必要的前提條件。

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(責任編委: 謝小冬)

Genetic screening of a pedigree with osteogenesis imperfecta type Ⅰand identification of a novel mutation in COL1A2 pathogenic gene

Rong Li1, Yuanping Guo2, Jingxin Pan3, Yibin Guo1
1. Department of Medical Genetics, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China; 2. Amateur Team, Department of Medical Genetics, Sun Yat-sen University/ Class 3, Senior 2, The 16th Middle School, Guangzhou 510080, China; 3. Department of Internal Medicine, The Second Affiliated Hospital, Fujian University of Medical Science, Quanzhou 362000, China

To uncover the molecular pathogenic mechanism of congenital osteogenesis imperfecta (OI) type I, all the 103 exons of the COL1A1 (Collagen, type Ⅰ, alpha 1) and COL1A2 (Collagen, type Ⅰ, alpha 2) genes in a child with OI type Ⅰ were screened using PCR-DNA direct sequencing. The results showed no pathological mutation in COL1A1gene, but a novel mutation c.946G>T/p.G316C in the exon 19 of COL1A2 gene, which was inherited from her father. This mutation was not found in her mother and other six phenotypically normal relatives. By denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) screening, the abnormal double-peak was visualized in PCR products of exon 19 of COL1A2 gene in the proband and her father, while the normal single-peak was shown in those of her mother and all the healthy controls. Using allele specific amplification (ASA) screening, a specific band of 391 bp in COL1A2 exon 19 was amplified only in the proband and her father, but not in other samples. The amino acid encoded by the mutation site is evolutionarily highly conserved, and this mutation was a “damaging” or “probably damaging” factor to OI type Ⅰ, based on the predicting results using SIFT and Polyphen-2 softwares. In conclusion, the novel c.946G>T/p.G316C mutation in COL1A2 gene is a pathogenic mutation that could result in OI type Ⅰ. If the couple wants to get pregnant again, it is necessary to screen the mutation site in COL1A2 gene through the prenatal genetic diagnosis in the first trimester or through preimplantation genetic diagnosis (PGD) in the progestation.

osteogenesis imperfecta type Ⅰ; C0L1A2 gene; novel mutation; pathogenic identification

2014-07-10;

2014-09-28

國家自然科學基金項目(編號：30772069)和閩粵橫向科研基金項目(編號：71010025)資助

李榮，碩士研究生，專業(yè)方向：醫(yī)學遺傳學。E-mail: banshou913@126.com

郭奕斌，副教授，碩士生導師，研究方向：遺傳病的分子診斷及產(chǎn)前/植入前基因診斷。E-mail: aguoabin@qq.com

10.16288/j.yczz.2015.01.006

時間： 2014-11-24 17:57:46

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141124.1757.003.html