薛 峰，曾德新，徐 飛，楊躍飛，王小波，張小榮，李震中，蔣 原

（1.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇南京 210001；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河北石家莊 050000）

空腸彎曲菌致GBS動物模型的建立

薛 峰1，曾德新1，徐 飛1，楊躍飛2，王小波2，張小榮2，李震中3，蔣 原1

（1.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇南京210001；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225009；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河北石家莊050000）

[目的]利用巴馬小香豬構(gòu)建空腸彎曲菌致GBS的動物模型。[方法]選取致人GBS源空腸彎曲菌株，采用3×1012cfu/mL、3×1011cfu/mL、3×1010cfu/mL、3×109cfu/mL等濃度對4組巴馬小型豬灌胃攻毒，每頭豬攻毒10mL，同時設(shè)立對照組。從第二周開始定期采集組織樣及血液樣本，通過免疫學(xué)檢測及組織病理切片判定病變情況。[結(jié)果]免疫學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在16份攻毒組樣品中有12份血清中GM1-IgG抗體檢測陽性，陽性檢出率為81.25%。但是，并沒有顯著的攻毒濃度梯度差異。病理組織切片H/E染色顯示，抗體陽性試驗豬的大腦出現(xiàn)了噬神經(jīng)元、小血管周圍間隙增寬、神經(jīng)中央染色溶解等現(xiàn)象；切片LFB染色顯示，在發(fā)病模型動物的小腦白質(zhì)和腰膨大出現(xiàn)了輕度脫髓鞘現(xiàn)象。[結(jié)論]結(jié)果表明空腸彎曲菌誘導(dǎo)GBS的濃度在3×109cfu/ mL～3×1012cfu/mL均可，組織樣本及血液采集在攻毒后4～5周較理想。

空腸彎曲菌；GBS；巴馬小香豬；動物模型

格林-巴利綜合征（GBS）又稱吉蘭-巴雷綜合征或急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病（AIDP），是由體液和細(xì)胞共同介導(dǎo)的單向性自身免疫性周圍神經(jīng)病[1]。誘發(fā)GBS的因素一般為空腸彎曲菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、肺炎支原體、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷性病毒等，其中最常見的是空腸彎曲菌，達(dá)到85%[2]。其病變以主要侵犯脊神經(jīng)根、脊神經(jīng)和顱神經(jīng)，有時也累及脊膜、脊髓及腦部。病變嚴(yán)重可致死，死亡率達(dá)5%～10%[3]。

盡管多年來此病一直受到廣泛關(guān)注，但至今對該病的治療扔無特效藥物。主要原因是空腸彎曲菌致GBS的致病機理尚不明確。目前一般認(rèn)為空腸彎曲菌致GBS是因為空腸彎曲菌的LPS上的LOS在分子結(jié)構(gòu)上與人類神經(jīng)節(jié)苷脂表位之間具有分子模擬現(xiàn)象，從而導(dǎo)致交叉免疫反應(yīng)。但是除了LOS外，是否還有其他大分子物質(zhì)參與誘發(fā)GBS；在自身免疫過程中機體內(nèi)還有哪些物質(zhì)起到了正向協(xié)調(diào)作用或是治療作用？如果能利用合適的動物模型找出這些關(guān)鍵因素，無疑對GBS的研究和治療將起到極大的幫助。至今，國際上尚未有公認(rèn)的空腸彎曲菌誘導(dǎo)GBS動物模型的報道。

在以往的研究中學(xué)者們已建立了多種動物模型。趙曉燕等用兔作為實驗動物構(gòu)建動物模型對O19型菌株對神經(jīng)的致病作用進(jìn)行研究[4]；C. Wim Ang等用小白鼠和兔作為模型，進(jìn)行GBS的相關(guān)免疫反應(yīng)研究[5]；Anthony P. Moran等用兔構(gòu)建動物模型，研究CJ誘導(dǎo)GBS的分子致病機制[6]；G. Parthasarathy等用豬構(gòu)建動物模型，研究CJ的侵染機制[7]。本研究擬采用廣西巴馬小香豬構(gòu)建動物模型。

1 材料

1.1 菌株及實驗動物

人源空腸彎曲菌LLcj由河北第二醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院李春巖院士惠贈；1月齡廣西巴馬小香豬購自上海交通大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑

Carry-Blair運送培養(yǎng)基購自中國科學(xué)院上海昆蟲科技開發(fā)公司；布氏肉湯、哥倫比亞血瓊脂購自O(shè)XOID公司；微氧產(chǎn)氣袋購自日本MGC公司；脫脂綿羊血購自南京助研生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

臺式冷凍離心機、快速混勻器、核酸蛋白檢測儀，德國Eppendoff公司；三氣培養(yǎng)箱，德國Binder公司；恒溫金屬?。–HB-100型），杭州大和熱磁電子有限公司；酶標(biāo)儀，美國 Thermo fi sher 公司；DMR顯微鏡、組織切片機，德國Lecia公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析軟件

SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件。

2 方法

2.1 菌株復(fù)蘇

將凍存菌株從-70 ℃冰箱中取出自然化凍。取200 μL菌液于5 mL布氏肉湯中，5%氧氣、10%二氧化碳、85%氮氣，37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)48h。

2.2 傳代培養(yǎng)

將復(fù)蘇菌株接種于哥倫比亞血平板，5%氧氣、10%二氧化碳、85%氮氣，37℃環(huán)境中培養(yǎng)48h。連續(xù)傳代2-3次，恢復(fù)菌株活性。

2.3 攻毒菌液的制備

挑取單菌落接種于布氏肉湯中（10% CO2，5% O2，85% N2，37 ℃）增菌48 h，4500 r/min離心5min后用生理鹽水調(diào)制終濃度分別為3×1012cfu/ mL、3×1011cfu/mL、3×1010cfu/mL、3×109cfu/ mL的菌懸液備用。

2.4 實驗動物分組

廣西巴馬小香豬20頭，體重3.5-4.0kg，雌雄各半，隨機分為5個組：對照組（4只）、高劑量攻毒組（4只）、中高劑量攻毒組（4只）、中劑量攻毒組（4只）及低劑量攻毒組（4只），采集各小豬血液，備用。動物試驗得到江蘇出入境檢驗檢疫局倫理委員會的任可和授權(quán)。

2.5 攻毒方法

攻毒前禁食12h，攻毒時每頭豬先灌注10 mL NaHCO3中和胃酸。高劑量組經(jīng)口灌注3×1012cfu/mL的菌懸液10mL；中高劑量組經(jīng)口灌注3×1011cfu/mL的菌懸液10 mL；中劑量組經(jīng)口灌注3×1010cfu/mL的菌懸液10mL；低劑量組經(jīng)口灌注3×109cfu/mL的菌懸液10mL；對照組口腔灌注生理鹽水10mL。

2.6 樣本采集

從第二周開始，每間隔一周各組選1頭小豬用于樣本采集。用BD Vacutainer血清采集管采集血液，血液采集完成后立即于4℃，4500 r/min離心30 min，吸取血清，置-70℃保存；采集大腦、小腦、腰膨大、頸膨大、坐骨神經(jīng)、臂神經(jīng)、動眼神經(jīng)等組織樣，經(jīng)4%福爾馬林固定，置液氮保存。24小時后，將4%福爾馬林固定的組織適當(dāng)清洗后重新存入新的4%的福爾馬林溶液。

2.7 免疫學(xué)檢測

ELISA檢測血清中GM1-IgG抗體成分[10]。用PBS將GM1稀釋至2 ug/mL，每孔100 μL，包被酶標(biāo)板4℃過夜；1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，37℃濕盒孵育2h；1：50稀釋血清血清樣本每孔100 μL，并設(shè)雙復(fù)孔，37℃孵育2h；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗3次，拍干；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，37℃ 孵育1h；PBST洗3次；顯色液（TMB）避光顯色15 min；2M硫酸終止顯色；450 nm波長讀值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件比較分析。

2.8 組織病理切片

將大腦、小腦、腰膨大、頸膨大、臂神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、動眼神經(jīng)等組織固定后，用石蠟包裹、切片，做成約0.4um厚的病理切片。每個組織樣本切6片，3片用于H/E染色，另外3片用于Luxol Fast Blue染色。切片用Leica DMR顯微鏡下觀察并攝影。

3 結(jié)果

3.1 免疫學(xué)檢測結(jié)果

棋盤法確定ELISA試驗中最佳血清稀釋度為1：50后，對20份血清樣本分別檢測，每份樣做3個平行重復(fù)。將對照組的4個檢測結(jié)果取平均值后分別同16個病理組進(jìn)行比較，以比值大于2.0者為檢測陽性。攻毒前20份血清均為GM1-IgG抗體檢測陰性；攻毒后，在16個病理組中有12份的血清中GM1-IgG抗體為檢測陽性，陽性檢出率為81.25%。4個對照樣血清均為檢測陰性，其他GM1-IgG抗體檢測陰性分別出現(xiàn)在高劑量組（1個）、中劑量組（2個）和低劑量組（1個）。在設(shè)計的梯度病理組中并沒有顯著的梯度差異（表1）。

表1 血清中GM1-IgG 抗體含量檢測結(jié)果

3.2 組織病理切片

分別對20頭豬的相應(yīng)組織做病理切片，每個組織做6張切片，3張用于H/E染色，3張用于LFB染色。根據(jù)病理切片觀察只有8頭豬經(jīng)H/E染色后能觀察到炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，其中低劑量組2個（分別采樣與第四周和第五周），中劑量組1個（采樣于第四周），中高劑量組3個（分別采樣于第四周和第五周），高劑量組2個（采樣于第五周）；且這8頭豬中只有2頭只有兩個經(jīng)LFB染色后能觀察到輕微脫髓鞘現(xiàn)象，其中中高劑量組1個（采樣于五周），高劑量組1個（采樣于第四周）。

3.2.1 H/E染色 切片H/E染色結(jié)果顯示，在發(fā)病模型動物的大腦出現(xiàn)了噬神經(jīng)元、小血管周圍間隙增寬、神經(jīng)中央染色溶解等現(xiàn)象（圖1）。

3.2.2 Luxol Fast Blue 染色 切片LFB染色結(jié)果顯示，在發(fā)病模型動物的小腦白質(zhì)和腰膨大出現(xiàn)了輕度脫髓鞘現(xiàn)象，（圖2）。

圖1 大腦H/E染色病理切片圖

圖2 LFB染色病理切片圖

4 討論

空腸彎曲菌是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌，對人的感染率不亞于沙門氏菌和志賀氏菌，特別是其作為前驅(qū)因子誘發(fā)GBS，對人類造成了極大的威脅。目前，空腸彎曲菌已引起人們廣泛關(guān)注。在研究空腸彎曲菌致病機理的過程中，研究人員構(gòu)建了多種動物模型，然而至今，國際上尚未有公認(rèn)的空腸彎曲菌誘導(dǎo)GBS動物模型的報道。

因此，我們決定模擬人感染GBS的模式，建立一個適用于研究空腸彎曲菌誘發(fā)GBS致病機理的動物模型。在模型動物選擇，鑒于豬在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、骨骼發(fā)育、營養(yǎng)代謝等方面與人類具有較大的相似性，利用豬構(gòu)建動物模型，可以極大程度上模擬人感染CJ、引發(fā)腸胃炎、GBS病發(fā)的整個過程；其次，巴馬小型豬在原產(chǎn)地均為長期近親交配形成的封閉群體，具有體型小、遺傳穩(wěn)定等特點，這樣既方便實驗操作，又保證可個體間在基因型方面的均一性，還便于后期基因表達(dá)的研究[8，9]。故用巴馬小型豬構(gòu)建動物模型可以保證此項研究的可操作性和科學(xué)性。在菌株選擇中，為保證菌株的致病能力以及與人的極大相關(guān)性，我們選擇了從GBS患者體內(nèi)分離得到的致人GBS源空腸彎曲菌。

在動物模型的構(gòu)建中，我們設(shè)立了4個梯度攻毒組和1個陰性對照組，期望了解不同攻毒劑量所達(dá)到的不同的免疫效果。根據(jù)免疫學(xué)檢測結(jié)果顯示，高劑量組在整體上略高于低劑量組，但是梯度攻毒組之間并沒有表現(xiàn)出顯著的梯度差異，而且有些高劑量組的免疫學(xué)反應(yīng)還明顯低于低劑量組。一方面，表明上述攻毒劑量均已達(dá)到或超過最適攻毒劑量；另一方面，也說明空腸彎曲菌作為前驅(qū)感染因子的不確定性，并非有空腸彎曲菌感染就會誘發(fā)免疫反應(yīng)或者并非高劑量的空腸彎曲菌就能引發(fā)高強度的免疫反應(yīng)，然而這可能與個體體質(zhì)差異有關(guān)。

綜合分析免疫學(xué)檢測結(jié)果，通過ELISA檢測血清中的GM1-IgG抗體，16份試驗組血清中只有12份血清檢測為GM1-IgG抗體陽性，陽性率達(dá)81.25%。這再次證明了CJ誘發(fā)GBS的不確定性，由于個體差異和其他方面因素，并非所有的模式動物感染CJ后都出現(xiàn)GBS癥狀；同時這也說明我們構(gòu)建動物模型成功，大部分模型動物都產(chǎn)生了自身免疫反應(yīng)，在其血清中都含有較高含量的GM1-IgG抗體，符合CJ感染相關(guān)軸索型GBS的分子模擬理論[10]。

先前研究表明，GBS癥狀會伴隨著神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)或者典型的脫髓鞘現(xiàn)象[11]，因此我們通過H/E染色和LFB染色來分析模型動物的病變情況。通過H/E染色，我們在12個免疫反應(yīng)陽性個體中發(fā)現(xiàn)有8個的相關(guān)組織出現(xiàn)了大腦噬神經(jīng)元、大腦小血管周圍間隙增寬、神經(jīng)元中央染色質(zhì)出現(xiàn)程度不等的溶解等病變現(xiàn)象；通過LFB染色，我們發(fā)現(xiàn)其中有2個免疫反應(yīng)陽性個體的小腦和腰膨大區(qū)域出現(xiàn)了典型的GBS病變癥狀即脫髓鞘。在12個免疫反應(yīng)陽性個體中，只有8個個體表現(xiàn)出了相應(yīng)的病變反應(yīng)且只有2個個體表現(xiàn)出了典型的GBS癥狀，這可能是由于空腸彎曲菌的感染只誘發(fā)的相應(yīng)的免疫反應(yīng)而沒有對相應(yīng)的組織造成實質(zhì)性的傷害，也有可能是因為大部分個體的自身免疫反應(yīng)對相關(guān)組織造成的損傷過于微妙，已至通過病理切片無法辨別。雖然只有2個個體出現(xiàn)了脫髓鞘現(xiàn)象，但這足以表明此動物模型構(gòu)建成功以及對空腸彎曲菌致GBS致病機理研究的實用性。

免疫學(xué)檢查表明，上述攻毒劑量均能達(dá)到病變要求，而病理切片結(jié)果則顯示在攻毒后第四周和第五周采集樣本的個體病變現(xiàn)象較為明顯，因此確定此動物模型的攻毒劑量在3×109cfu/mL～3×1012cfu/mL均可，組織樣本及血液的采集的最佳時機為攻毒后4～5周。

[1] Ryan MM. Guillain-Barre syndrome in childhood [J]. J Paediater Child Health，2005，41：237 - 241.

[2] Schmidt OR，Schmidt H，F(xiàn)eldmann S，et al. Improved serological diagnosis stresses the major role of Campylobacter jejuni in triggering guillain-barré syndrome [J]. Clin Vaccine Immunol，2006，13（7）：779-783.

[3] Wegmuller B，Luthy J，Candrian U. Direct polymerase chain reaction detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in raw milk and dairy products[J]. Appl Environ Microbiol，1993，59（12）： 4378-4383.

[4] 趙曉燕，薛平，劉瑞春，等. 空腸彎曲菌抗體對兔周圍神經(jīng)致病作用的研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1999，6（16）：325-327.

[5] Ang CW，Dijkstra JR，Klerkk MA，et al. Host Factors Determine Anti-GM1 Response Following Oral Challenge of Chickens with Guillain-Barre Syndrome Derived Campylobaceter jejuni Strain GB11 [J]. J Plos ONE，2010，5：e9820.

[6] Moran AP，et al. Antibodies induced by ganglioside-mimicking Campylobacter jejuni lipooligosaccharides recognise epitopes at the nodes of Ranvier [J]. Journal of Neuroimmunology，2005，165（1/2）：179-185.

[7] Parthasarathy G，et al. Recombinant interleukin-4 enhances Campylobacter jejuni invasion of intestinal pig epithelial cells（IPEC-1）[J]. Microbial Pathogenesis，2009，47（1）：38-46.

[8] Feng W H，Laster S M，Tompkins M，et al. In utero infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus is suffi cient to increase susceptibility of piglets to challenge by Streptococcus suis type Ⅱ [J]. J Virol，2001，75（10）：4889-4895.

[9] 王愛德. 廣西巴馬小型豬的選育研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（3）：160.

[10] Wang XH，Shu XM，Yang BZ. Study on the critical antigen that induces immune damage of peripheral nerve following Campylobacter jejuni infection [J]. J Clin Pediatr，2011，29（1）：68-72.

[11] Gregson NA，et al. Reactivity of serum IgG anti-GM1 ganglioside antibodies with the lipopolysaccharide fractions of Campylobacter jejuni isolates from patients with Guillain-Barre syndrome（GBS）[J]. Journal of Neuroimmunology，1997，73（1/2））：28-36.

Establishment of the Animal Model for C. jejuni Induced GBS

Xue Feng1，Zeng Dexin1，Xu Fei1，Yang Yuefei2， Wang Xiaobo2，Zhang Xiaorong2，Li Zhengzhong3，Jiang Yuan1
（1.Animal and Plant and Food Inspection Center，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210001；2.College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3 Department of Neurology，The Second Hospital Affiliated to Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050000）

[Objective] Bama mini-pig was used to establish the animal model for C. jejuni induced GBS. [Methods] C. jejuni isolate inducing GBS in human was selected to infect pigs. Four groups，each with four pigs，were orally infused respectively with four concentration bacterial suspension of 3×1012cfu/mL，3×1011cfu/mL，3×1010cfu/mL and 3×109cfu/mL. A control group was set up and orally infused with normal saline. From the second week，blood and tissue samples were collected regularly to determine the immune reaction and lesions by ELISA and biopsy. [Results] 12 of 16 samples in the infected groups were positive for GM1-IgG antibodies with a positive rate of 81.25%. However，there was no signifi cant difference between the groups infected with different concentration gradients. The H/E staining revealed neuronophagia，enlarged Virchow-Robin spaces，central chromatolysis and so on in the cerebrum of the infected animals；LFB staining showed mildly demyeliantion in the cerebellar white matter and the lumbar enlargement of the infected animals. [Conclusion]The result showed that the C. jejuni concentration for inducing GBS in minipigs was 3×109cfu/mL～3×1012cfu/mL and the best time to collect blood and tissue samples was 4～5 weeks after inoculation.

Campylobacter jejuni；GBS；Bama mini-pig；animal model

R-332；R378.3

：A

：1005-944X（2015）02-0019-05

國家質(zhì)檢總局科研項目（2013IK164）；江蘇省333工程培養(yǎng)基金資助項目（BRA2012205）；國家863項目（2012AA101001）

蔣原

注：前三位作者同等貢獻(xiàn)