郭艷萍， 趙金安

（太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

酵素是一種功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，通常以水果和蔬菜為原料，經(jīng)過(guò)一種或多種有益菌發(fā)酵取得，含有豐富的礦物質(zhì)、維生素以及微生物次生代謝產(chǎn)物［1］。人類(lèi)幾乎所有的生理生化反應(yīng)都離不開(kāi)酵素的參與，體內(nèi)酵素活力的高低和數(shù)量的多少與人體的衰老、疾病密切相關(guān)。隨著年齡的增加，酵素在體內(nèi)的活力及含量逐漸降低，衰老加速，疾病來(lái)襲，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充所需酵素勢(shì)在必行。

酵素源于日本，主要以稻米為原料發(fā)酵生產(chǎn)。截至目前，其研發(fā)和生產(chǎn)工藝均是世界先進(jìn)水平，且尚屬保密階段。鑒于此，酵素產(chǎn)品無(wú)論是發(fā)酵過(guò)程還是生產(chǎn)工藝都有進(jìn)一步研究的必要。

大麥?zhǔn)鞘澜缟纤拇蠹Z食作物之一，也是我國(guó)最主要的農(nóng)作物之一，在我國(guó)的產(chǎn)量非常高。近年來(lái)，許多研究表明，大麥中含有許多功能性成分，這些成分大多對(duì)人體有益，可以調(diào)節(jié)人體的新陳代謝［2］。本實(shí)驗(yàn)以大麥為原料，研究其經(jīng)天然發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的大麥天然酵素具有的抗氧化能力，為進(jìn)一步探明天然酵素中的活性物質(zhì)提供一定的數(shù)據(jù)資料，同時(shí)，為進(jìn)一步改進(jìn)生產(chǎn)工藝提供一定的技術(shù)支持，為大麥的多功能開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大麥，山西省農(nóng)科院；白糖，市售一級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大麥酵素的制備

無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)菌水洗凈大麥，放置于超凈工作臺(tái)中自然晾干。晾干后用植物細(xì)胞粉碎機(jī)將其磨成粉末，再用電子天平稱取9份，每份質(zhì)量均為20g。白糖也對(duì)應(yīng)稱取9份，質(zhì)量分別為10、20、30g，各3份。之后，放置于超凈工作臺(tái)中，用紫外燈滅菌1h。選用9個(gè)已滅菌的玻璃瓶，貼簽備用。將已滅菌的白糖以及大麥粉末放入對(duì)應(yīng)的玻璃瓶當(dāng)中，封口，放置于恒溫培養(yǎng)箱中于35℃發(fā)酵49d。間隔7d取一定量的發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)高速離心后取上清液，進(jìn)行抗氧化性的測(cè)定。

1.2.2 總酚含量的測(cè)定［3］

9.18mL去離子水、0.2mL酚試劑中加入20μL酵液樣品，經(jīng)過(guò)3min完全反應(yīng)后，加入0.6mL Na2CO3溶液（質(zhì)量體積比20%），25℃水浴鍋中恒溫振蕩2h，測(cè)定吸光度A760（去離子水作參比溶液）。

1.2.3 羥基自由基清除率的測(cè)定［4］

2mL 1.5mmol／L FeSO4，1.4mL 6mmol／L H2O2、0.6mL 20mmol／L水楊酸鈉的混合溶液中加入135μL酵液樣品，37℃恒溫水浴1h。在562nm處測(cè)定吸光度A260（去離子水作參比溶液）。羥基自由基清除率的計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為樣品測(cè)定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.4 DPPH 清除率的測(cè)定［4］

4mL 0.1mmol／L DPPH－甲醇溶液、450μL 50mmol／L tris－鹽酸緩沖溶液（pH＝7.4）的混合溶液中加入40μL酵液樣品，25℃恒溫水浴1h。在517nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)517（去離子水作參比溶液）。自由基清除率計(jì)算公式同式（1）。

1.2.5 超氧自由基清除率的測(cè)定［4］

50μL酵液樣品，950μL磷酸緩沖液（0.1mol／L，pH＝7.4），1mL 120μmol／L PMS，1mL 936μmol／L NADH和1mL 300μmol／L NBT，室溫反應(yīng)5min。在560nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)560（去離子水作參比溶液）。自由基清除率計(jì)算公式同式（1）。

1.2.6 ABTS自由基清除率的測(cè)定［4］

7mmol／L ABTS，加 入 K2S2O8至 濃 度 為2.45mmol／L，20℃下暗反應(yīng)16h。加入稀釋過(guò)的酵液樣品10μL，在30℃溫度下充分反應(yīng)5min。在734nm處測(cè)定相應(yīng)吸光度值A(chǔ)734（去離子水作參比溶液）。自由基清除率計(jì)算公式同式（1）。

2 結(jié)果與討論

2.1 大麥酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化

本實(shí)驗(yàn)中總酚的含量采用酚試劑法來(lái)測(cè)定，吸光度值與總酚含量成正比。大麥酵素的總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而不斷變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 總酚含量在發(fā)酵過(guò)程中的變化

在天然發(fā)酵過(guò)程中，大麥天然酵素總酚含量變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，從圖1可見(jiàn)，其變化規(guī)律呈逐漸上升的趨勢(shì)。在發(fā)酵的第6周，即發(fā)酵42d時(shí)，總酚含量達(dá)到最大，相對(duì)于發(fā)酵初期平均增加了52.92%，到發(fā)酵結(jié)束為止總酚含量平均增加29.25%。我們推測(cè)，酵液中大分子酚類(lèi)物質(zhì)被微生物轉(zhuǎn)化成小分子酚類(lèi)物質(zhì)，引起了總酚含量的增加。

研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，白糖含量不同的對(duì)照組的總酚含量差別不大，且變化趨勢(shì)相同。而從圖1可以看出，在第5周時(shí)總酚含量均達(dá)到最大值，表明在此發(fā)酵過(guò)程中，白糖的加入量對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化基本沒(méi)有影響。

2.2 大麥天然酵素對(duì)羥基自由基清除率的變化

羥基自由基是自然界中僅次于氟的強(qiáng)氧化劑，具有高度的損傷性，每一個(gè)活細(xì)胞都能被其氧化。以清除率來(lái)表示發(fā)酵過(guò)程中大麥天然酵素對(duì)羥基自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 羥基自由基清除率在發(fā)酵過(guò)程中的變化

從圖2可看出，羥基自由基的清除能力呈波浪式變化，波動(dòng)范圍較大，但基本無(wú)規(guī)律可循。同樣，對(duì)于大麥酵素來(lái)說(shuō)，白糖的加入量與羥基自由基的清除能力之間也沒(méi)有一定的規(guī)律。

2.3 大麥天然酵素對(duì)DPPH自由基清除率的變化

DPPH自由基清除能力是短時(shí)間內(nèi)測(cè)定抗氧化能力的重要方法。DPPH自由基更廣泛地用于抗氧化性能的評(píng)價(jià)，因?yàn)槠漭^羥基自由基和超氧自由基更穩(wěn)定。發(fā)酵過(guò)程中大麥天然酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力，以清除率來(lái)表示，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DPPH自由基清除率在發(fā)酵過(guò)程中的變化

由圖3可看出，隨著天然發(fā)酵的進(jìn)行，大麥天然酵素對(duì)DPPH自由基的清除率上升了2.89%，在第35d達(dá)到最高值，平均清除率為96.58%。同其他3種自由基相比，大麥天然酵素對(duì)DPPH自由基的清除率最高。

2.4 大麥天然酵素對(duì)超氧自由基清除率的變化

超氧自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，加快肌體的衰老過(guò)程，并可誘發(fā)癌癥、心血管疾病等，嚴(yán)重危害人體健康。以清除率來(lái)表示發(fā)酵過(guò)程中大麥天然酵素對(duì)超氧自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4看出，大麥天然酵素對(duì)超氧自由基的清除率整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但變化不顯著。在發(fā)酵過(guò)程中上升了2.95%，并在第35d達(dá)到最高值，平均清除率為58.70%。同樣，糖量對(duì)于超氧自由基的清除無(wú)影響。

圖4 超氧自由基清除率在發(fā)酵過(guò)程中的變化

2.5 大麥天然酵素對(duì)ABTS自由基清除率的變化

圖5為ABTS自由基清除率在發(fā)酵過(guò)程中的變化。從圖5看出，在天然發(fā)酵的進(jìn)行過(guò)程中，大麥天然酵素對(duì)ABTS自由基清除能力不斷增加，前5周增加幅度較大，后期趨于平穩(wěn)。經(jīng)過(guò)7周后，酵液對(duì)ABTS自由基的平均清除率升高至83.82%，發(fā)酵前后提高了10.20%。與DPPH自由基和超氧自由基相比，大麥天然酵素對(duì)ABTS自由基清除提高幅度最大。糖量對(duì)于ABTS自由基的清除能力無(wú)影響。

圖5 ABTS自由基清除率在發(fā)酵過(guò)程中的變化

2.6 大麥酵素發(fā)酵過(guò)程中抗氧化能力與總酚含量的相關(guān)性

通過(guò)計(jì)算羥基自由基、DPPH自由基、超氧自由基及ABTS自由基清除能力與總酚含量的相關(guān)性系數(shù)，分析大麥天然酵素發(fā)酵過(guò)程中抗氧化性能與總酚含量的相關(guān)性。各組酵液樣品對(duì)羥基自由基的清除能力與總酚含量之間的相關(guān)性系數(shù)基本小于0.3，可以認(rèn)定羥基自由基的清除能力與總酚含量之間沒(méi)有相關(guān)性。DPPH自由基、超氧自由基和ABTS自由基清除能力與總酚含量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.922、0.838、0.964，均顯示具有顯著正相關(guān)性。

3 結(jié)論

以大麥為原料，在天然條件下經(jīng)過(guò)大麥原有的有益微生物發(fā)酵產(chǎn)生的大麥酵素有較好的抗氧化能力。發(fā)酵過(guò)程中總酚含量上升了29.25% ；DPPH自由基、超氧自由基和ABTS自由基清除能力呈逐漸增加趨勢(shì)，發(fā)酵前后分別提高了2.89%、2.95%和10.20%。結(jié)論表明，在天然發(fā)酵過(guò)程中，大麥酵素展現(xiàn)了與酚類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)性較大的抗氧化能力。本研究結(jié)果可為大麥的多功能開(kāi)發(fā)利用、天然酵素產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供一定的支持。

［1］ 毛建衛(wèi)，吳元鋒，方晟.微生物酵素研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2010，39（3）：42－43.

［2］ 夏向東，呂飛杰，臺(tái)建祥.大麥中的生理活性成分及其生理功能［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2002，2（3）：63－66.

［3］ Singleton V L，Orthofer R，Lamuela－Raventos R M.A－nalysis of total polyphenols and other oxidationsubstrates and antioxidants by means of Folin－Ciocalteau reagent［J］.Methods in Enzymology，1999，299：152－178.

［4］ Larrauri J A，Snchezmoreno C，Sauracallixto.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape peels［J］.Agric Food Chem，1998，46：2694.