侯 穎， 儲(chǔ) 敏， 蔡燕飛， 杜芳芳， 王曉敏， 陳 蘊(yùn)， 金 堅(jiān)

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

整合素金屬蛋白酶家族蛋白 （a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）， 也 被 稱 為 MDC（Metalloproteinase/Disintegrin/Cysteine-rich），是一類錨定于細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白家族[1]，自1990年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)家族成員以來(lái)[2]，迄今為止共有23種ADAM家族蛋白在人類基因中被發(fā)現(xiàn)。ADAM家族蛋白參與蛋白水解、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞的融合、遷移、粘附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物功能[3]。在病理學(xué)中，ADAM家族蛋白亦參與了炎癥和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。ADAM家族蛋白中，ADAM15被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在多種實(shí)體瘤發(fā)生時(shí)，如胃癌、肝癌、前列腺癌等，ADAM15的表達(dá)都會(huì)上調(diào)[4-5]。另外，由于ADAM15的去整合素區(qū)域含有整合素結(jié)合位點(diǎn)RGD（arginine-glycine-asparti，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列，具有典型的藥物分子靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征，因此有希望作為臨床腫瘤診斷的標(biāo)志物及藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。

人ADAM15去整合素區(qū)域蛋白由91個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為9 805，作者所在實(shí)驗(yàn)室成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并分離純化出重組人ADAM15去整合素區(qū)域蛋白，記為rhddADAM15（recombinant human disintegrin domain of ADAM15）[6]。作者以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為模型，檢測(cè)了rhddADAM15對(duì)HeLa增殖及遷移的影響，并初步確定了rhddADAM15作用機(jī)理及其相關(guān)的信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究其對(duì)腫瘤的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

rhddADAM15：由作者所在實(shí)驗(yàn)室制備；人宮頸癌細(xì)胞HeLa：購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)細(xì)胞所用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、小牛血清、青霉素、鏈霉素：購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶：購(gòu)自碧云天公司；脂質(zhì)體Lipo2000：購(gòu)于Invitrogen公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用各種孔板：購(gòu)自Corning公司；SRB：購(gòu)自Sigma公司；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及 U0125：購(gòu)自 Cell signaling公司；CM-Dil：購(gòu)自 Invitrogen公司；兔源抗rhddADAM15的一抗：由作者所在實(shí)驗(yàn)室制作保存；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗：購(gòu)自碧云天公司；細(xì)胞周期試劑盒：購(gòu)自南京凱基生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞采用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，添加1×105U/L的青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至所需要密度時(shí)用胰蛋白酶消化處理，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并根據(jù)需要重懸成所需濃度。

1.2.2 SRB法測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，用含10%小牛血清的培養(yǎng)基稀釋至 （0.6～0.8）×108個(gè)/L，每孔100 μL鋪于96孔板，培養(yǎng)24 h后，吸除培養(yǎng)基，將含有不同濃度的rhddADAM15、絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路的激動(dòng)劑表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及MAPK通路中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制劑U0125的細(xì)胞培養(yǎng)液分別加入至96孔板。各個(gè)藥物的各個(gè)濃度設(shè)置至少3個(gè)副孔，同時(shí)設(shè)置不加任何藥物的孔為陰性對(duì)照及不鋪細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去各孔培養(yǎng)基，加入100 μL的10%TCA溶液固定40 min后，棄去TCA溶液，超純水洗板2次，在空氣中干燥后每孔加入100 μL的0.4%SRB溶液，于37℃孵育30 min，棄去SRB溶液，用1%醋酸溶液清洗至無(wú)色后甩干，每孔加入100 μL 的 10 mmol/L Tris溶液，10 min 后利用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)其吸光值。

1.2.3 劃痕法測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，用10%牛血清的培養(yǎng)基稀釋至 （0.6～0.8）×108個(gè)/L，每孔100 μL，均勻鋪于96孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底80%～90%時(shí)，用槍頭在孔底均勻筆直的劃出約1 mm細(xì)痕，PBS輕輕洗2～3次，洗去劃掉的細(xì)胞，加入含有不同濃度的rhddADAM15的細(xì)胞培養(yǎng)液，在0、24 h時(shí)分別定點(diǎn)拍照，觀察并記錄細(xì)胞遷移情況。 遷移計(jì)算公式為式（2）、（3）：

1.2.4 PI單染法測(cè)細(xì)胞周期 處于對(duì)數(shù)期的待檢測(cè)細(xì)胞消化后鋪于 6 孔板，每孔（3～4）×105個(gè)，生長(zhǎng)24 h 后 加 入 終 濃 度 分 別 為 0、1.5、4 μmol/L 的rhddADAM15繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，PBS洗滌、胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，再用PBS洗滌兩遍后，70%的冷乙醇固定2 h至過(guò)夜，洗去固定液，經(jīng)PBS清洗后收集細(xì)胞，加入50 μg/mL的RNAase，于37℃孵育30 min后，加入PI置于4℃避光染色，0.5 h后上機(jī)檢測(cè)。數(shù)據(jù)利用Modfit軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 人ADAM15去整合素區(qū)域在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以作者所在實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pGEX-4T-1/ddADAM15作為模板，利用以下引物克隆人 ADAM15去整合素區(qū)域：上游引物，5’-CCGCTCGAGCGGGCCACCATGGCTGCTTTCTGC-3’， 下游引物 5’-TAAAGCGGCCGCAAATTTACTC GCCATCCCCT-3’。將PCR產(chǎn)物純化后，利用XhoI及NotI酶切，連于pCI-neo載體。構(gòu)建好的pCI-neo/ddADAM15質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，利用Lipo2000轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株記做HeLa/AD。轉(zhuǎn)染4、6 h后，收集細(xì)胞并裂解收取蛋白質(zhì)，利用抗rhddADAM15的一抗進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，分析細(xì)胞內(nèi)人ADAM15去整合素區(qū)域蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.2.6 斑馬魚體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞移植模型 本實(shí)驗(yàn)與杭州環(huán)特生物技術(shù)有限公司合作開展，所用斑馬魚為野生型斑馬魚，由環(huán)特生物技術(shù)有限公司培養(yǎng)提供。本實(shí)驗(yàn)用魚為斑馬魚幼魚。斑馬魚的繁殖以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為巴馬司他，陰性對(duì)照為PBS溶液。

1）腫瘤細(xì)胞移植：HeLa生長(zhǎng)至聚合度為90%以上后，棄去培養(yǎng)液，用 PBS洗滌2～3遍，加入 1 mL質(zhì)量濃度為5 μg/mL熒光素CM-Dil溶液，將培養(yǎng)瓶置于4℃冰箱。15 min后棄去CM-Dil溶液，用PBS洗滌2～3遍，消化收集標(biāo)記好的細(xì)胞，置于冰上待用。將受精48 h的斑馬魚置于0.4%三卡因甲磺酸進(jìn)行麻醉后，利用顯微注射儀將約800個(gè)標(biāo)記好的HeLa細(xì)胞注入斑馬魚卵黃囊，以此作為腫瘤細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的移植模型。

2）rhddADAM15給藥：HeLa細(xì)胞移植到斑馬魚體內(nèi)24 h后，在熒光顯微鏡下挑選腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，即熒光強(qiáng)度較亮的斑馬魚，將不同量的rhddADAM15，PBS（陰性對(duì)照）及巴馬司他（陽(yáng)性對(duì)照，450 ng/魚）顯微注射到斑馬魚體內(nèi)，每組至少10條。繼續(xù)飼養(yǎng)48 h后，將斑馬魚麻醉固定后拍照，利用尼康NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析。熒光強(qiáng)度（S）表示細(xì)胞的增殖程度，面積（A）表示細(xì)胞的遷移程度。rhddADAM15對(duì)斑馬魚體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率及遷移抑制率計(jì)算公式為式（4）～（5）。

2 結(jié)果與討論

2.1 rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞增殖及遷移

SRB檢測(cè)法顯示rhddADAM15對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有明顯抑制，抑制率隨著rhddADAM15濃度的升高而增大，在0～8 μmol/L內(nèi)呈劑量依賴性，見圖1。數(shù)據(jù)分析得，rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞增殖的IC50為2.44 μmol/L。利用劃痕法顯示rhddADAM15對(duì)HeLa細(xì)胞的遷移能力也有明顯抑制，且呈劑量依賴性，計(jì)算得rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞遷移的 IC50為 1.60 μmol/L。

圖1 rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞增殖及遷移Fig.1 rhddADAM15 inhibited the proliferation and migration of HeLa cells

2.2 ADAM15去整合素區(qū)域蛋白過(guò)表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞的遷移及細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染4、6 h后，利用Western blot分析HeLa/AD細(xì)胞內(nèi)ADAM15去整合素區(qū)域蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)染4 h后，ADAM15去整合素區(qū)域蛋白已有表達(dá)，6 h后表達(dá)水平較高。因此我們選擇轉(zhuǎn)染后6 h作為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)HeLa細(xì)胞周期及遷移能力的變化。

如表1所示，與正常HeLa細(xì)胞相比，HeLa/AD的遷移抑制率為 18.27%±2.15%， 而 4 μmol/L rhddADAM15作用于HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的遷移抑制率為96.37%±2.35%，抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HeLa/AD；rhddADAM15處理后，HeLa細(xì)胞的S期含量上升約4%，G2/M期含量下降約3.1%，G0/G1期下降約1%；與rhddADAM15處理后的HeLa細(xì)胞相似，和野生型HeLa細(xì)胞相比，HeLa/AD細(xì)胞也具有S期的部分阻滯，阻滯率約為5%，G2/M期含量下降約3%。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組S期含量下降，G2/M期略微升高，證明轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞周期也有一定影響。

圖2 ADAM15去整合素區(qū)域蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.2 Expression of the disintegrin domain of ADAM15 in HeLa cells

表1 HeLa/AD及HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)rhddADAM15處理后的細(xì)胞周期及遷移能力變化Table 1 Cell cycle arrest and migration inhibition of Hela/AD or HeLa cells treated with rhddADAM15

2.3 相關(guān)通路抑制劑及激動(dòng)劑對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖影響

rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞的增殖，阻滯其細(xì)胞周期，為了研究rhddADAM15抑制HeLa細(xì)胞增殖作用相關(guān)的通路，考察了MAPK通路激動(dòng)劑EGF及ERK1/2通路抑制劑U0125對(duì)rhddADAM15處理后HeLa細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)中所用rhddADAM15的濃度為1.0 μmol/L，EGF濃度為0.8 nmol/L，U0125濃度為 10 nmol/L， 結(jié)果見圖 3。rhddADAM15可抑制HeLa細(xì)胞的增殖（柱1），EGF可促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖并可逆轉(zhuǎn)rhddADAM15引起的細(xì)胞增殖抑制 （柱2，3），在EGF的作用下，rhddADAM15對(duì)HeLa細(xì)胞增殖并沒有抑制效果，只是減弱EGF對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 （柱3）；U0125同樣也能抑制HeLa細(xì)胞的增殖 （柱4），rhddADAM15與U0125聯(lián)用會(huì)使HeLa的增殖抑制增強(qiáng) （柱 5）；EGF可以逆轉(zhuǎn) U0125及 U0125與rhddADAM15聯(lián)用引起的增殖抑制作用 （柱6、7），即 EGF存在下，U0125及 U0125與 rhddADAM15聯(lián)用并不能引起HeLa細(xì)胞的增殖抑制，HeLa細(xì)胞仍會(huì)有一定程度的增殖促進(jìn)。

圖3 rhddADAM15，EGF，及U0125對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of rhddADAM15，EGF，and U0125 on the proliferation of HeLa cells

2.4 rhddADAM15對(duì)斑馬魚體內(nèi)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響

圖4 rhddADAM15抑制斑馬魚體內(nèi)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移Fig.4 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the proliferation and metastasis of HeLa cells in zebrafish xenografts

HeLa細(xì)胞移植于斑馬魚體內(nèi)后，可以正常生長(zhǎng)，如圖4A所示，移植3 d以后，HeLa細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)增殖并轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為紅色熒光范圍變廣。經(jīng)過(guò)陽(yáng)性對(duì)照巴馬司他及rhddADAM15處理后，斑馬魚體內(nèi)HeLa細(xì)胞的熒光面積減小，亮度變暗 （圖4B）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，rhddADAM15作用后斑馬魚體內(nèi)HeLa細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及熒光面積減弱呈劑量依賴性，在rhddADAM15最大非致死劑量，即7.5 pmol/魚的劑量下，rhddADAM15對(duì)HeLa細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)增殖的抑制率為53%±1.49%，轉(zhuǎn)移抑制率為51%±2.83%；在巴馬司他最大非致死劑量，即490 pmol/魚的劑量下，巴馬司他對(duì)HeLa細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)生長(zhǎng)的抑制率為39%±2.51%，轉(zhuǎn)移抑制率為43%±2.90%。

3 結(jié)語(yǔ)

整合素作為存在于細(xì)胞表面的重要黏附分子，可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化與凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用[7-8]。去整合素可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制阻斷整合素與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，干擾由整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，rhddADAM15對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，有較為廣譜的抗癌性[4，10]。 在本研究中，rhddADAM15可以顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞在體外及斑馬魚體內(nèi)的增殖及轉(zhuǎn)移，抑制效果呈劑量依賴性；rhddADAM15處理后，HeLa細(xì)胞S期阻滯率約4%；而通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使ADAM15去整合素區(qū)域蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)，得到HeLa/AD細(xì)胞，其遷移能力較野生型HeLa細(xì)胞有微弱的下降，S期阻滯率約為5%。以上實(shí)驗(yàn)證明，rhddADAM15作為外源蛋白及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的內(nèi)源蛋白，均可抑制細(xì)胞的遷移及誘導(dǎo)S期阻滯，雖然抑制及誘導(dǎo)強(qiáng)度不同，仍可說(shuō)明rhddADAM15在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞表面均有其作用靶點(diǎn)。

rhddADAM15發(fā)揮功能的一個(gè)重要活性位點(diǎn)為其可與整合素相互作用的RGD序列[4]。細(xì)胞的生存與增殖，都需要與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，整合素是細(xì)胞表面受體的主要家族，對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附起介導(dǎo)作用。整合素參與了一系列的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)蛋白激酶，生長(zhǎng)因子受體和離子通道的活性，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織。整合素還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，控制細(xì)胞存活、增殖、退出細(xì)胞周期或者細(xì)胞分化[8]。Chong等發(fā)現(xiàn)，ADAM15激活Src/Erk途徑，來(lái)調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞的通透性及中性粒細(xì)胞的遷移[11]。MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及遷移方面發(fā)揮重要作用，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[12]。本研究表明，EGF可以逆轉(zhuǎn)rhddADAM15及rhddADAM15與ERK抑制劑U0125引起的HeLa細(xì)胞增殖抑制，表明rhddADAM15對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制與MAPK通路密切相關(guān)。雖然對(duì)于rhddADAM15的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制仍不清楚，但是本研究為進(jìn)一步探究rhddADAM15參與的激酶級(jí)聯(lián)激活過(guò)程提供了研究方向，為rhddADAM15的成藥性提供了研究基礎(chǔ)。

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