廖紫超，張偉妮，黃小紅，石妹妹

(福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建福州350002)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)隸屬弧菌科(Vibrionacea)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭氏陰性短桿菌，普遍存在于淡水、污水、淤泥和土壤中，可引起淡水養(yǎng)殖魚類的暴發(fā)性敗血癥，是20世紀(jì)80年代末以來引發(fā)中國、菲律賓、泰國和印度等亞洲國家傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性疾病的最重要病原之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1].人類也可因致病性嗜水氣單胞菌感染而引起腹瀉及食物中毒，該菌已成為人、獸和魚共患的條件致病菌[2]，因此研制疫苗以實現(xiàn)免疫預(yù)防極為重要.

革蘭氏陰性菌外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)是外膜的主要結(jié)構(gòu)，占其全部組成的1/2.許多研究證實，細(xì)菌的Omp在細(xì)菌致病過程中起著重要的作用，可激發(fā)機體的體液免疫，并可引發(fā)細(xì)胞免疫，是一種潛在的共同保護性抗原[3－4].弧菌(36 ku)、OmpK、GAPDH Omp和遲鈍愛德華菌(37 ku)的Omp都已被列入疫苗開發(fā)的對象[5－11].Maiti et al[12]克隆了嗜水氣單胞菌OmpW基因，得出OmpW可能是氣單胞菌屬的共同保護性抗原.劉明智等[13]研究表明，重組嗜水氣單胞菌OmpW可作為草魚嗜水氣單胞菌基因工程亞單位候選疫苗.Ni et al[14]從嗜水氣單胞菌J-1菌株中克隆表達并純化Omp38，兔抗該蛋白的抗體能識別包括J-1菌株在內(nèi)的多株不同血清型的嗜水氣單胞菌.然而目前對嗜水氣單胞菌Omp的研究多是單個蛋白獨立進行，缺乏系統(tǒng)全面地篩選和分析.

本試驗以一株已鑒定為日本鰻鱺腐皮病病原的嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)322A為研究材料，用十二烷基肌氨酸鈉抽提結(jié)合超速離心的方法分離提取該致病性嗜水氣單胞菌的Omp，通過SDS-PAGE分析其Omp成分組成，并通過蛋白質(zhì)印跡確定Omp的抗原性.同時，將322A與4種氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的蛋白質(zhì)印跡進行比較，探討322A與其他氣單胞菌Omp成分的異同.本試驗旨在系統(tǒng)地篩選322A具免疫原性的膜蛋白抗原，為進一步研制開發(fā)嗜水氣單胞菌Omp亞單位疫苗提供理論依據(jù).

表1 供試氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Table 1 Standard strains of Aeromonas for testing

1 材料與方法

1.1 材料

致病性嗜水氣單胞菌322A[15]和氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 JS07332、Fp60325NA、0060、AS0068(表 1)由福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)動植物病原庫提供.羅非魚由福建省淡水水產(chǎn)研究所閩侯基地提供.純系新西蘭兔由福州市藥檢所提供.兔抗羅非魚IgM血清來自福建省淡水水產(chǎn)研究所.

丙烯酰胺(Acr)、雙丙烯酰胺(Bis)和十二烷基肌氨酸鈉為AMRESCO產(chǎn)品，十二烷基硫酸鈉(SDS)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司.HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司.TMB顯色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司.DAB顯色液購自天根生化科技(北京)有限公司.

LB固體培養(yǎng)基[16]:10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉、15 g瓊脂、1000 mL水.

1.2 Omp 的提取

將菌株接種在LB固體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水沖洗收集以用于Omp的抽提.Omp的提取采用改進的十二烷基肌氨酸鈉法[17]，具體程序如下:將菌苔收集于生理鹽水中，振蕩混勻;于4℃、3000×g離心洗滌3次，每次20 min，沉淀用20 mmol·L－1Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸;全菌超聲波破碎4 min(振幅39%;工作3 s，間隔3 s);破碎菌于3000×g離心10 min，取上清于23000×g離心30 min，沉淀用含 400 μL 15 mmol·L－1Tris-HCl緩沖液(pH 7.6，含2.25%十二烷基肌氨酸鈉)、1.4 mL 10 mmol·L－1Tris-HCl緩沖液(pH 7.6，含1.5%十二烷基肌氨酸鈉)和100 μL重蒸水的混合溶液重懸，32℃水浴30 min后于23000×g離心30 min，沉淀用20 mmol·L－1Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)重懸后于23000×g離心30 min.上述各步驟離心均于4℃下進行，用10 mmol·L－1PBS(pH 7.4)重懸沉淀，即為收集的Omp.樣品置－20℃保存.用上述方法大量提取氣單胞菌的Omp，用Folin-酚法[18]測定提取的Omp的含量.

1.3 Omp中各分離蛋白分子質(zhì)量的分析

采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳.樣品與電泳上樣緩沖液[含0.25 mol·L－1Tris-HCl(pH 6.8)、10%SDS、5%巰基乙醇、50%甘油和0.5%溴酚藍]等體積混勻，煮沸5 min，冷卻后加樣，每孔上樣蛋白量為 10 μg.采用 Tris-甘氨酸電泳緩沖液(含 0.125 mol·L－1Tris、1.25 mol·L－1Tris-甘氨和 0.5%SDS，pH 8.3)，于4℃下電泳.丙烯酰胺含12%分離膠和5%濃縮膠.濃縮膠部分恒壓為80 V，分離膠部分恒壓為120 V.電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍R250染色后用凝膠系統(tǒng)成像儀掃描，Gel-Pro軟件分析各分離蛋白的分子質(zhì)量及其相對百分含量.

1.4 羅非魚感染322A全菌后恢復(fù)期血清的制備

1.4.1 菌懸液的制備 將322A接種于LB固體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，于28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h.用McFarland比濁法將細(xì)菌濃度固定為3×108CFU·mL－1.

1.4.2 魚恢復(fù)期血清的制備 羅非魚感染組每尾腹腔注射0.1 mL上述菌懸液，對照組每尾注射等量的0.85%無菌生理鹽水.在感染細(xì)菌后第15天分別從感染組和對照組隨機各取5尾羅非魚，尾靜脈采血，室溫傾斜放置1 h后置4℃過夜，次日于4℃、340×g離心15 min得到魚恢復(fù)期和陰性血清.

1.4.3 魚恢復(fù)期血清效價的測定 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(間接ELISA)法，參照鄢慶枇等[19]的方法并加以改進.酶標(biāo)板各孔加入0.1 mL嗜水氣單胞菌懸液(108CFU·mL－1)，于4℃過夜包被，然后用ELISA洗滌液(PBST)洗滌5次，每次5 min;各孔加入200 μL封閉液，于37℃封閉2 h，PBST洗滌5次，每次5 min;各孔加入系列稀釋的羅非魚血清0.1 mL，于37℃溫育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min;加入兔抗羅非魚IgM血清(用ELISA封閉液稀釋5000倍)0.1 mL，于37℃溫育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min;加入羊抗兔IgG-HRP血清(稀釋10000倍)0.1 mL，于37℃溫育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min;各孔加入0.1 mL TMB底物溶液，于37℃避光溫育15 min;各孔加入50 μL 2 mol·L－1H2SO4終止反應(yīng).結(jié)果判定:用酶標(biāo)儀檢測樣品的D450nm，當(dāng)P/N=檢測孔的D450nm/陰性孔的D450nm≥2.1時，即判為陽性.

1.5 兔抗嗜水氣單胞菌Omp血清的制備

1.5.1 兔抗血清的制備 免疫純系新西蘭兔，具體免疫程序如下:基礎(chǔ)免疫，Omp懸液與弗氏完全佐劑按1∶1的比例混勻，皮下注射0.2 mL;3周后加強免疫，Omp懸液與弗氏不完全佐劑按1∶1的比例混勻，皮下注射0.2 mL;5周后第2次加強免疫，Omp懸液與弗氏不完全佐劑按1∶1的比例混勻，皮下注射0.2 mL;7周后第3次加強免疫，Omp懸液與弗氏不完全佐劑按1∶1的比例混勻，皮下注射0.2 mL.第3次加強免疫后第6天抽血檢測抗體效價大于500000，第7天從頸動脈一次性采血，室溫傾斜放置1 h后置4℃過夜，次日于4℃、340×g離心15 min，得到兔抗血清.

1.5.2 兔抗血清效價的測定 采用間接 ELISA 法[20]測定.抗原用0.05 mol·L－1磷酸鹽(pH 9.6)包被(0.2 μg·孔－1，即 100 μL·孔－1)，置 4 ℃孵育過夜，用 0.05%Tween-20(PBST)洗滌 3 次，每次 5 min;每孔加入100 μL封閉液，于37℃封閉60 min，用0.05%Tween-20(PBST)洗滌3次，每次5 min;將兔子的血清按1∶1000的比例稀釋，然后倍比稀釋，每孔加入100 μL，于37℃孵育1 h，用0.05%Tween-20(PBST)洗滌3次，每次5 min;辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)按1∶10000的比例稀釋，每孔加入100 μL，于37 ℃孵育45 min，取出用0.05%Tween-20(PBST)洗滌5次，每次5 min;每孔加入100 μL TMB 底物溶液反應(yīng)15 min;最后加入100 μL 2 mol·L－1H2SO4終止反應(yīng).結(jié)果判定:用酶標(biāo)儀檢測樣品的D450nm，當(dāng)P/N=檢測孔的D450nm/陰性孔的D450nm≥2.1時，即判為陽性.

1.6 魚恢復(fù)期血清和兔抗血清的蛋白質(zhì)印跡檢測

322A Omp分別做兩次SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，凝膠均用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)(BioRad公司)轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素膜上，于20 mA轉(zhuǎn)移1 h.硝酸纖維素膜在含有5%脫脂奶粉的TBST(含0.1%Tween-20的TBS緩沖液)緩沖液于4℃封閉過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min;然后將膜分別浸在用封閉液稀釋1000倍的兔抗322A Omp血清和用封閉液稀釋100倍的魚恢復(fù)期血清中室溫溫育5 h.用TBST洗膜3次，每次10 min.浸在兔抗322A Omp血清中的膜置于封閉液稀釋10000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG血清中室溫溫育1 h;用TBST洗膜3次，每次10 min;最后將膜用DAB顯色5－10 min，晾干.而浸在魚恢復(fù)期血清的膜置于封閉液稀釋2000倍的兔抗羅非魚IgM血清中室溫溫育5 h;用TBST洗膜3次，每次10 min;然后置于封閉液稀釋10000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG血清中室溫溫育1 h;用TBST洗膜3次，每次10 min;最后將膜用TMB顯色5－10 min，晾干.兩張硝酸纖維素膜均用凝膠系統(tǒng)成像儀(BioRad公司)拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 血清效價和Omp含量

2.1.1 血清效價 間接ELISA法測得魚感染322A后恢復(fù)期血清的效價為1∶400，兔抗322A Omp血清的效價為1∶500000.

2.1.2 Omp 含量 Folin-酚法測得 322A、JS07332、Fp60325NA、0060、AS0068和大腸桿菌的Omp的含量分別為 2.1、2.4、1.8、2.5、2.7 和 3.1 mg·mL－1.

2.2 322A與其他菌株Omp的SDS-PAGE分析

圖1 322A與其他菌株Omp的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of OMPs in strain 322A and the other strains

322A、JS07332、Fp60325NA、0060、AS0068 和大腸桿菌Omp的SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示.322A Omp的條帶有 13 條，其中，主要條帶有9 條，分子質(zhì)量分別為 103、45、43、37、33、28、20、18 和 16 ku，另有一些較為模糊的條帶，其分子質(zhì)量分別為67、54、50和39 ku.用Gel-Pro軟件分析處理各Omp分子質(zhì)量和相對百分含量的結(jié)果(表2)表明，5株氣單胞菌一般都有5－13條條帶，且分子質(zhì)量多集中在20－50 ku之間.其中，28 ku的條帶為5株氣單胞菌所共有，且相對百分含量分別為8.91%、12.6%、9.91%、16.7%和23.8%，而作為陰性對照的大腸桿菌則沒有.

表2 322A和其他菌株Omp的分子質(zhì)量和含量Table 2 Molecular weight and percentage content of OMPs in strain 322A and the other strains

2.3 羅非魚恢復(fù)期血清和兔抗322A Omp血清對Omp的蛋白質(zhì)印跡

從羅非魚感染322A后的恢復(fù)期血清對322A Omp的蛋白質(zhì)印跡(圖2)可以看出，免疫反應(yīng)發(fā)色帶有4條，分子質(zhì)量分別為28、37、43和45 ku.從兔抗322A Omp血清對322A Omp的蛋白質(zhì)印跡(圖3)可以看出，免疫反應(yīng)發(fā)色帶有5條，分子質(zhì)量分別為28、33、37、43和45 ku.圖2、3顯示，魚恢復(fù)期血清對Omp的蛋白質(zhì)印跡與兔抗322A對Omp的蛋白質(zhì)印跡有4條相同的免疫反應(yīng)條帶，它們的分子質(zhì)量分別為28、37、43 和45 ku.

圖2 羅非魚恢復(fù)期血清對322A Omp的蛋白質(zhì)印跡Fig.2 Western-blot of OMPs with tilapia convalescent antiserum

圖3 兔抗322A Omp血清對Omp的蛋白質(zhì)印跡Fig.3 Western-blot of OMPs with rabbit antiserum against OMPs of 322A

3 討論

本試驗進行SDS-PAGE分析的結(jié)果表明，供試致病性嗜水氣單胞菌322A Omp的條帶主要有13條，分子質(zhì)量為15－110 ku，主要集中在28－45 ku之間.此結(jié)果與董傳甫等[4]報道的“嗜水氣單胞菌主要Omp條帶的分子質(zhì)量為26－50 ku”的結(jié)果基本一致.同種細(xì)菌由于血清型等存在差異，因此其Omp有差別，這種差別可能影響到菌株的致病性[21].

本試驗的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，羅非魚感染322A后恢復(fù)期的血清和兔抗322A Omp的血清與322A 13條Omp分別只有28、37、43和45 ku 4條蛋白和28、33、37、43和45 ku 5條蛋白可發(fā)生程度不等的陽性反應(yīng)，表明這些Omp具有一定的抗原性.可見，對于不同的感染宿主和感染途徑，無論是全菌還是Omp作為免疫抗原，322A 13條Omp中的28、37、43和45 ku 4條蛋白均具有免疫原性.

革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜由脂多糖、蛋白質(zhì)和脂蛋白組成，外膜含有與重要的細(xì)胞功能相關(guān)的各種蛋白.研究表明，細(xì)菌的Omp免疫原性強，是重要的保護性抗原.董傳甫等[4]以嗜水氣單胞菌主要Omp制備Omp免疫刺激復(fù)合物疫苗，在歐洲鰻免疫中獲得了較好的免疫保護效果.嗜水氣單胞菌中分子質(zhì)量為43 ku的Omp AHA1是一種重要的粘附素，克隆此粘附素并在大腸桿菌中表達，重組蛋白免疫藍吻魚獲得了較高的保護力[22].本試驗結(jié)果表明，分子質(zhì)量為28、37、43和45 ku的Omp都具有抗原性，同時發(fā)現(xiàn)28 ku的Omp為5株氣單胞菌所共有，可能是氣單胞菌屬共有的特異性抗原，為進一步研制開發(fā)氣單胞菌Omp的廣譜亞單位疫苗提供理論依據(jù).

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