曾麗蘭，林玉玲，王亞婷，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002)

1975年，植物種質(zhì)離體保存首次被提出，在植物界引起了高度重視［1］.根據(jù)保存原理的差異可以將離體保存分為限制生長(zhǎng)保存和超低溫保存.限制生長(zhǎng)保存是指通過(guò)添加生長(zhǎng)延緩劑或抑制劑、提高培養(yǎng)基滲透壓、降低溫度、改變光照條件、降低氣壓等條件來(lái)限制培養(yǎng)物生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)繼代間隔時(shí)間.要提高培養(yǎng)基的滲透壓，可以通過(guò)添加滲透試劑造成一個(gè)滲透勢(shì)負(fù)值，同時(shí)產(chǎn)生水分逆境，使植物細(xì)胞吸水相對(duì)困難，植物組織因缺水而減弱新陳代謝，與此同時(shí)植物的細(xì)胞壁酶的活性也受到抑制，最終實(shí)現(xiàn)延緩生長(zhǎng)的目的.目前較為常用的滲透試劑有蔗糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇等.有研究表明高滲試劑可以起到延緩植物細(xì)胞衰老和提高細(xì)胞活力的作用.

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，自身逐漸形成了一系列應(yīng)答逆境脅迫的生理、代謝以及防御系統(tǒng)，如植物細(xì)胞內(nèi)自身形成了清除有害的自由基和活性氧的保護(hù)酶類系統(tǒng)［2］.其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是清除活性氧反應(yīng)過(guò)程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，且廣泛參與植物體在各種逆境脅迫下的生理生化反應(yīng)，對(duì)抗衰老和抗干旱都起到積極的作用，因此，研究SOD在各種逆境脅迫中發(fā)揮的作用具有重大意義.目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于SOD對(duì)各種逆境脅迫的研究主要有低溫、水分、高鹽、光照、有毒氣體、化學(xué)藥劑、病害等.

龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是我國(guó)南方廣泛種植的重要熱帶亞熱帶果樹(shù)，目前有關(guān)龍眼SOD及其它抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶的活性變化的研究已有少量報(bào)道，蔡英卿等［3］對(duì)不同成熟期龍眼品種及不同器官(根、枝、葉、新梢)中的 SOD 活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，根(65.05 U·g－1)＞葉(61.88 U·g－1)＞ 枝(51.13 U·g－1)＞新梢(47.70 U·g－1);許家輝等［4］檢測(cè)晚熟龍眼果實(shí)掛樹(shù)期的果皮中的H2O2、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、SOD、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性變化，發(fā)現(xiàn)SOD活性在整個(gè)掛樹(shù)保鮮期內(nèi)無(wú)顯著差異;李惠華等［5］和邵巍等［6］研究龍眼離體胚胎中抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性變化并對(duì)同工酶譜進(jìn)行分析，在龍眼各個(gè)階段胚性培養(yǎng)物中均檢測(cè)到 APX活性，在后三個(gè)階段酶活性迅速提高，在子葉形胚時(shí)酶活性最高;陳義挺等［7－8］研究了NaCl、光和溫度脅迫對(duì)龍眼胚性愈傷組織谷胱甘肽過(guò)氧化物還原酶(glutathione peroxidase，GPX)和POD酶活性的影響，結(jié)果表明，隨著鹽脅迫和光強(qiáng)的不斷增強(qiáng)，GPX活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，白光處理的GPX活性均高于綠光，隨著溫度的不斷降低，GPX活性先升高后降低，高溫(30℃)或低溫(20℃)處理后龍眼體胚發(fā)生早期各階段胚性培養(yǎng)物的POD活性均明顯大于對(duì)照(25℃)，隨著胚性細(xì)胞的分化，POD活性總體呈下降趨勢(shì);林小蘋(píng)等［9］檢測(cè)不同光質(zhì)條件下POD、SOD和CAT的活性變化，結(jié)果表明，不同光質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)有不同效應(yīng)，藍(lán)光對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而白光則有抑制作用;林玉玲［10］對(duì)龍眼活體胚胎或離體胚胎發(fā)生過(guò)程中SOD的酶活性變化及同工酶譜的分析研究表明，SOD對(duì)胚性細(xì)胞的分化以及晚期胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用，但關(guān)于滲透脅迫對(duì)龍眼SOD保護(hù)酶活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道.滲透脅迫通常是由干旱、鹽漬化和低溫造成的，研究表明，SOD在植物抗性中起到最為重要的作用［11－12］.為探討SOD與龍眼抗衰老和抗旱性之間的關(guān)系，本研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、甘露醇和蔗糖這3種高滲溶液，對(duì)龍眼胚性愈傷組織(emryogenic callus，EC)進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，研究在不同滲透脅迫下龍眼胚性愈傷組織中SOD的變化，以期找到龍眼在離體保存過(guò)程中有關(guān)延緩生長(zhǎng)，延長(zhǎng)繼代時(shí)間的方法，還可以為研究龍眼抗干旱滲透脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為福建農(nóng)林大學(xué)亞熱帶果樹(shù)研究所長(zhǎng)期繼代保存的龍眼“紅核子”品種胚性愈傷組織LC2細(xì)胞系［13］.繼代保持采用 MS+2，4-D 1.0 mg·L－1+蔗糖20 g·L－1(簡(jiǎn)稱 M1 培養(yǎng)基)和 MS+2，4-D 1.0 mg·L－1+KT 0.5 mg·L－1+AgNO30.5 mg·L－1+蔗糖 20 g·L－1(簡(jiǎn)稱 M2 培養(yǎng)基)兩種培養(yǎng)基交替培養(yǎng)［13－14］.

1.2 方法

1.2.1 龍眼胚性愈傷組織的脅迫處理 取M1培養(yǎng)基上繼代20 d并生長(zhǎng)良好的紅核子龍眼胚性愈傷組織，分別放入 PEG(0、10、20、30 g·L－1)、甘露醇(0、20、30、40、60、80、100 g·L－1)和蔗糖(0、20、30、50、70、90 g·L－1)的MS液體培養(yǎng)基中，搖床中振蕩培養(yǎng)24 h(25℃，150 r·min－1)，后放于濾紙上晾干，液氮速凍儲(chǔ)存于－80℃超低溫冰箱，供測(cè)試.

1.2.2 滲透脅迫下龍眼胚性愈傷組織SOD酶活性變化的測(cè)定 采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)還原法［15］，用0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 7.8)提取，4 ℃下離心20 min(10000 r·min－1)，上清液為SOD粗提液，然后進(jìn)行還原反應(yīng)，將各顯色反應(yīng)體系在4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min(各管受光一致).反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管做空白，用Cary 50型紫外光光度計(jì)在560 nm處比色測(cè)定.活力單位以抑制NBT光化學(xué)還原50%作為一個(gè)酶活性單位(U)，用(U·g－1)表示，3次重復(fù).

結(jié)果按下式進(jìn)行計(jì)算:

式中:VT表示樣品液總體積(mL);VS表示測(cè)定時(shí)樣品用量(mL);W表示愈傷組織鮮質(zhì)量(g);Ack表示照光對(duì)照管吸光度;AE表示樣品管吸光度.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2003和DPS數(shù)據(jù)處理軟件處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫下龍眼胚性愈傷組織的SOD活性變化

PEG是一種高分子滲透劑，能夠迅速奪取水分從而對(duì)植物造成滲透脅迫.試驗(yàn)以龍眼胚性愈傷組織為材料，測(cè)定不同含量PEG對(duì)龍眼胚性愈傷組織SOD活性的影響，結(jié)果見(jiàn)表1.從表1可以看出，經(jīng)10和20 g·L－1PEG處理，SOD活性上升，而在30 g·L－1PEG處理下SOD活性呈下降趨勢(shì)，且變化顯著.10 g·L－1PEG處理的SOD活性極顯著高于對(duì)照，20 g·L－1PEG處理的SOD活性也極顯著高于10 g·L－1PEG處理組，30 g·L－1PEG處理的SOD活性呈下降趨勢(shì)，且極顯著低于20 g·L－1PEG，說(shuō)明PEG脅迫的進(jìn)程較快，PEG溶于水后立即產(chǎn)生較高的滲透壓，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，激發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)SOD酶系統(tǒng)的保護(hù)能力，所以PEG脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞的SOD活性迅速升高，隨著自由基急劇增加，對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)造成傷害，導(dǎo)致SOD活性顯著下降.

表1 不同PEG脅迫處理對(duì)龍眼EC的SOD活性變化的影響Table 1 Effects of PEG stress on SOD activities in the embryogenic callus of longan

2.2 甘露醇滲透脅迫下龍眼胚性愈傷組織的SOD活性變化

甘露醇的作用機(jī)理是降低細(xì)胞膨壓，提高培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境.試驗(yàn)以龍眼胚性愈傷組織為材料，測(cè)定不同濃度甘露醇脅迫處理下的龍眼胚性愈傷組織的SOD活性變化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可以看出，隨著甘露醇濃度的不斷升高(20－80 g·L－1)，龍眼胚性愈傷組織中的SOD活性不斷升高，且一直維持在一個(gè)較高的水平上，說(shuō)明脅迫處理下細(xì)胞中SOD活性被誘導(dǎo)升高，直到濃度高達(dá)100 g·L－1時(shí)才開(kāi)始呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這可能是由于高濃度處理超出了細(xì)胞的生理耐受和反應(yīng)極限，破壞了正常細(xì)胞生理活動(dòng)引起的.20 g·L－1甘露醇的SOD活性極顯著高于對(duì)照，濃度在20－30 g·L－1之間的SOD活性上升緩慢，40 g·L－1的SOD活性極顯著高于20 g·L－1，濃度在40－60 g·L－1之間的SOD活性上升也較緩慢，的SOD活性極顯著高于20 g·L－1的，且能使其SOD活性維持在一個(gè)較高的水平上，在峰值 80 g·L－1時(shí)的 SOD 活性達(dá)到140.07 U·g－1，比 PEG 脅迫達(dá)到的峰值134.63 U·g－1高，說(shuō)明高濃度的甘露醇可以有效增強(qiáng)龍眼胚性愈傷組織的SOD活性.

表2 不同甘露醇脅迫處理對(duì)龍眼EC的SOD活性變化的影響Table 2 Effects of mannitol stress on SOD activities in the embryogenic callus of longan

2.3 蔗糖滲透脅迫下龍眼胚性愈傷組織的SOD活性變化

蔗糖既是植物組織培養(yǎng)中的最主要碳源，也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).試驗(yàn)以龍眼胚性愈傷組織為材料，測(cè)定不同濃度蔗糖脅迫處理下的龍眼胚性愈傷組織的SOD活性變化(以20 g·L－1蔗糖為對(duì)照)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可以看出，隨著蔗糖濃度的升高，20－50 g·L－1濃度的蔗糖處理下，龍眼胚性愈傷組織中的SOD活性不斷升高，50 g·L－1后開(kāi)始下降，70－90 g·L－1的蔗糖處理下，SOD活性下降緩慢.30 g·L－1蔗糖處理的SOD活性極顯著高于20 g·L－1處理和對(duì)照，50 g·L－1蔗糖處理的SOD活性極顯著高于20 g·L－1的處理，可能是由于當(dāng)滲透脅迫達(dá)到一定程度，SOD活性耐旱機(jī)制形成，有效地清除龍眼胚性愈傷組織內(nèi)多余的活性氧;50 g·L－1蔗糖處理后SOD活性開(kāi)始下降，70－90 g·L－1處理的SOD活性下降緩慢，說(shuō)明隨脅迫濃度的升高，“紅核子”龍眼胚性愈傷組織內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的平衡關(guān)系被打破，“紅核子”龍眼胚性愈傷組織內(nèi)活性氧的積累在一定程度上抑制了SOD活性.蔗糖濃度50 g·L－1時(shí)的SOD活性達(dá)到峰值140.39 U·g－1，比PEG脅迫達(dá)到的峰值134.63 U·g－1高，說(shuō)明高濃度的蔗糖可以增強(qiáng)龍眼胚性愈傷組織的SOD活性.

表3 不同濃度蔗糖脅迫處理對(duì)龍眼EC的SOD活性變化的影響Table 3 Effects of sucrose stress on SOD activities in the embryogenic callus of longan

3 討論

3.1 甘露醇和蔗糖可以有效提高植物細(xì)胞活力

甘露醇的作用機(jī)理是降低細(xì)胞膨壓，提高培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，使水分和養(yǎng)分吸收受阻，減少營(yíng)養(yǎng)消耗［16］.高濃度的蔗糖也會(huì)形成高滲透壓環(huán)境，抑制細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收.

本研究中隨著甘露醇和蔗糖濃度的不斷升高，龍眼胚性愈傷組織中的SOD活性不斷升高，且維持在一個(gè)較高水平上，但當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到100 g·L－1時(shí)，SOD活性開(kāi)始呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì);當(dāng)蔗糖濃度升高到70 g·L－1時(shí)，SOD活性呈緩慢下降趨勢(shì).查向東等［17］的研究也表明，甘露醇處理下的葉片細(xì)胞SOD活性被誘導(dǎo)增強(qiáng).

甘露醇與植物的抗逆性有關(guān)，將甘露醇合成酶轉(zhuǎn)入煙草，有利于提高植株對(duì)高鹽的耐受性，甘露醇作為一種重要的多元醇，還可直接清除·OH抵抗氧化反應(yīng)［18］，說(shuō)明甘露醇也是一種活性氧清除劑［19，20］.

在植物離體保存研究中，常利用甘露醇和蔗糖來(lái)延緩細(xì)胞衰老，以達(dá)到延長(zhǎng)繼代時(shí)間的目的.但是不同植物培養(yǎng)物保存所需要滲透壓并不相同，研究表明，試管苗保存時(shí)間以及恢復(fù)生長(zhǎng)率受培養(yǎng)基中高滲物質(zhì)含量影響的變化趨勢(shì)基本都呈拋物線型.Divakaran et al［21］將香草在MS+15 g·L－1蔗糖+15 g·L－1甘露醇培養(yǎng)基上進(jìn)行保存，每年只需要繼代1次.李黛等［22］將淡黃花百合在MS培養(yǎng)基(含1%－3%甘露醇)中進(jìn)行保存，保存10個(gè)月的組培苗仍然具有92%存活率，而其存活的組培苗100%可以正常地生長(zhǎng)和增殖.葉煒［23］、林秀蓮［24］和徐清鋒［25］研究表明，甘露醇對(duì)質(zhì)膜系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用，較高濃度的甘露醇處理可使龍眼胚性愈傷組織的SOD活性升高，但考慮延緩衰老和正常生長(zhǎng)，均在培養(yǎng)基中加入20 g·L－1甘露醇.

本試驗(yàn)中在甘露醇和蔗糖脅迫下的SOD活性達(dá)到的最高值大于PEG脅迫下的最高值，且SOD活性的下降速度較緩慢，而PEG的脅迫進(jìn)程太快，先迅速升高后迅速下降.徐清鋒［25］比較不同濃度PEG對(duì)龍眼離體的保存效果，結(jié)果表明，PEG不能延長(zhǎng)其保存時(shí)間，且非常不利于材料生長(zhǎng).龍眼胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)中，高濃度蔗糖同樣能夠提供很高的滲透壓，但其抑制衰老的作用卻較甘露醇相距甚遠(yuǎn).林秀蓮［24］的研究表明，50 g·L－1的蔗糖最有利于龍眼胚性愈傷組織的繼代保存。本研究表明，蔗糖為50 g·L－1時(shí)，SOD活性最高，細(xì)胞活力也最高.

甘露醇和蔗糖雖然在提高植物細(xì)胞活力和延緩細(xì)胞衰老上起到一定作用，但是在植物的離體保存研究中，由于不同植物培養(yǎng)物保存所需要滲透壓并不相同，因材料而異，甘露醇和蔗糖的濃度都應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，才能保證材料正常生長(zhǎng)、延長(zhǎng)繼代時(shí)間.

3.2 滲透脅迫下龍眼胚性愈傷組織SOD的響應(yīng)機(jī)制

SOD作為植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，可以作為植物細(xì)胞的抗旱指標(biāo).在植物抗旱性的研究中，PEG、甘露醇和蔗糖等高滲溶液模擬干旱脅迫處理是作物抗旱性室內(nèi)鑒定的常用方法［26－27］.

本試驗(yàn)對(duì)龍眼愈傷組織進(jìn)行不同PEG含量的水分脅迫處理，結(jié)果表明，SOD活性在輕度、中度脅迫時(shí)上升，嚴(yán)重脅迫時(shí)呈下降趨勢(shì).目前，眾多學(xué)者研究了PEG脅迫對(duì)不同植物SOD活性的影響，石永紅等［28］、張衛(wèi)華等［29］、王胤等［30］、許桂芳［31］等的研究表明，在 PEG 脅迫下，植物細(xì)胞中 SOD 活性呈先升高后下降的趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明脅迫處理引起細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，激發(fā)了植物細(xì)胞內(nèi)SOD酶系統(tǒng)的保護(hù)能力，導(dǎo)致SOD活性顯著升高，隨著脅迫的加深，逐漸超過(guò)保護(hù)酶系統(tǒng)的清除能力，高濃度的PEG脅迫可能對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)造成傷害，導(dǎo)致SOD活性呈現(xiàn)不斷下降趨勢(shì).

PEG是一種高分子滲透劑，能夠迅速奪取水分對(duì)植物造成滲透脅迫［27，32－33］，甘露醇、蔗糖和PEG脅迫一樣都能使植物細(xì)胞處于一種滲透脅迫中，但是PEG脅迫的進(jìn)程較快，PEG溶于水后立即能產(chǎn)生強(qiáng)大的滲透壓，所以PEG脅迫中植物細(xì)胞中的SOD活性能迅速升高，但是隨著自由基的急劇增加，對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)造成傷害，因此在30%PEG脅迫處理下其SOD活性大幅度下降，徐清鋒［25］的研究表明，PEG無(wú)法延長(zhǎng)其保存時(shí)間，不利于材料生長(zhǎng).

本試驗(yàn)結(jié)果表明，甘露醇(20－80 g·L－1)處理的龍眼胚性愈傷組織中的SOD活性維持在較高水平，蔗糖(20－50 g·L－1)處理的龍眼胚性愈傷組織中的SOD活性也維持在較高水平.說(shuō)明甘露醇和蔗糖脅迫處理下，細(xì)胞中SOD活性顯著被誘導(dǎo)增加.王娟等［34］用外源甘露醇和蔗糖處理水分脅迫下的玉米根系，結(jié)果表明，甘露醇和蔗糖可顯著促進(jìn)SOD活性，在4種有機(jī)溶質(zhì)(甘露醇、蔗糖、甜菜堿、脯氨酸)中，甘露醇對(duì)酶活性的促進(jìn)作用最為顯著，蔗糖次之，而且甘露醇和蔗糖處理過(guò)的玉米根系，在幾天連續(xù)的干旱脅迫下，SOD活性下降緩慢，SOD活性變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致.在滲透脅迫下，植物的普遍響應(yīng)機(jī)制是通過(guò)積累相溶性溶質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)［35］，因?yàn)楦事洞己驼崽蔷鶎儆诩?xì)胞相溶性物質(zhì)，外施適當(dāng)濃度的甘露醇和蔗糖有利于減少自由基對(duì)膜系統(tǒng)的損傷.耐旱植物與甜土植物的顯著差異即前者積累溶質(zhì)的能力強(qiáng)，因此可通過(guò)外施相溶性物質(zhì)來(lái)提高植物的耐旱性，細(xì)胞相溶性物質(zhì)在細(xì)胞低滲透勢(shì)的條件下可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低滲透勢(shì).本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞相溶性物質(zhì)可提高干旱條件下細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，使植物的保護(hù)酶活性增加，減少自由基對(duì)膜系統(tǒng)的損傷，提高植物的抗?jié)B透能力.

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