史棟棟， 況媛媛， 王桂明， 彭章曉， 王 彥， 閻 超

（上海交通大學(xué)，上海200240）

代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究方法，是通過考察生物體系受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后）其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化來研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)［1］。它不僅能夠研究藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化，還能夠研究藥物本身的代謝和動力學(xué)變化，更能直接反映藥物干預(yù)下體內(nèi)生物學(xué)變化和動力學(xué)變化［2］。通過認識生物體代謝指紋圖譜變化的原因，闡明藥物的作用機理，用代謝組學(xué)方法研究所揭示的生物化學(xué)變化很容易與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果聯(lián)系，更容易評價藥效作用和發(fā)現(xiàn)藥物作用的生物化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制［3］。代謝組中常用的分析平臺有GC-MS、LC-MS和NMR 等，其中GC-MS優(yōu)良的定性和定量分析能力，加上其龐大的化合物譜庫為鑒定工作帶來了很大的便利，使得GC-MS 在代謝組學(xué)研究中顯示出突出的優(yōu)勢［4，5］。

羽扇豆醇屬于三萜類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥等植物中［6］。大量的體外和動物實驗證明羽扇豆醇在抗炎、抗菌、抗瘧疾、抗惡性腫瘤增殖、抗血管再生等方面有很大的潛能［7］，并且已經(jīng)有實驗證明羽扇豆醇對胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等腫瘤有明顯的抗癌活性［8，9］。因此，羽扇豆醇是具有很大潛力的天然抗腫瘤藥物。

本課題以羽扇豆醇作用于乳腺癌細胞，基于GC-MS聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的生物代謝差異標(biāo)志物，并結(jié)合細胞周期實驗結(jié)果對羽扇豆醇作用于乳腺癌細胞MCF-7的機理進行深入研究，從代謝組學(xué)的角度為羽扇豆醇的抗腫瘤機制提供新的線索。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PEGASUS 4D GC×GC-TOF／MS（美國LECO公司）；LNG-T88 臺式快速離心濃縮干燥器、L-35低溫冷阱（太倉市華美生化儀器廠）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；XW-80A 漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔培養(yǎng)板（丹麥Nunc公司）；全自動酶標(biāo)分析儀（美國Thermo公司）；流式細胞儀FACSCalibur（美國BD 公司）；

胎牛血清購于美國Gibco公司，DMEM／HIGH GLUCOSE DMEM 培養(yǎng)基、PBS（磷酸鹽）緩沖液、胰蛋白酶均購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司（北京）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、RNaseA 酶購于美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；吡啶（分析純）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硅烷化試劑N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）（含1% 三甲基氯硅烷（TMCS））購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；甲氧胺、2-氯苯丙氨酸均購自美國Sigma公司。

人乳腺癌細胞MCF-7購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 MTT 實驗測定羽扇豆醇對細胞增殖的影響

將MCF-7 細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，配成含量為4×104個細胞／mL，接種于96 孔板，每孔接種100μL（4×103個細胞／孔）。培養(yǎng)12 h后添加藥物羽扇豆醇，使其質(zhì)量濃度梯度為10、25、50、100、200μg／mL。每組5個復(fù)孔。加完藥后置于5%CO2培養(yǎng)箱中，于37 ℃恒溫下繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)的時間梯度為24、48、72 h。然后加入20 μL5 mg／mL的MTT溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液，每孔加入150μL DMSO，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（A），計算平均吸光度和抑制率。抑制率＝（對照組的A 值-實驗組的A 值）／（對照組A值-空白組A 值）×100%。

1.3 細胞提取及衍生方法

取一皿對數(shù)生長期的細胞，倒掉培養(yǎng)基，用生理鹽水（0.9%NaCl水溶液）清洗3遍以去除培養(yǎng)基中復(fù)雜物質(zhì)的影響。清洗完畢后，液氮猝滅以防止活細胞在環(huán)境變化下代謝發(fā)生變化，影響代謝物的考察。液氮猝滅后，每皿加入1 000μL 甲醇-水（4∶1，v／v）溶液，用細胞刮刀刮下細胞置于樣品瓶（玻璃）中，在樣品瓶中加入少量氯仿（體積為前述甲醇-水溶液體積的1、5），使得細胞中的非極性成分溶在提取液中。然后加入10μL 0.3 mg／mL 的2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)。渦漩，于4 ℃細胞超聲破碎儀中破碎細胞（功率20%，破碎3 min，期間開5 s，關(guān)5 s），使代謝物質(zhì)全部溶出，更加全面地提取代謝物。在4 ℃、4 000 r／min下離心15 min，去除大分子蛋白等物質(zhì)。

取800μL上述上清液至GC 進樣瓶中，室溫下真空干燥，用氮氣對樣品進行再次干燥后，加入80 μL甲氧胺（15 mg／mL，溶劑為吡啶），混合1 min，于30℃下反應(yīng)90 min后，加入80μL BSTFA 和40 μL正己烷，于70 ℃下反應(yīng)90 min。

1.4 GC-TOF／MS條件

色譜柱為DB-5MS 色譜柱（30 m×250μm×0.25μm，安捷倫科技有限公司）；進樣量為1μL。進樣口溫度為270℃，程序升溫：起始溫度為80℃，保持2 min，以10℃／min升至180 ℃，以5 ℃／min升至240 ℃，以5 ℃／min升至290 ℃，保持9 min。接口溫度為260 ℃；離子源溫度為200 ℃。載氣為氦氣，載氣流速為1 mL／min。電子能量70 eV，全掃描方式，掃描范圍為m／z 30～600，以20張／s的速率采集TOF質(zhì)譜圖。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方式

將GC-MS 獲得的所有原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過ChromaTOF軟件（v3.30，Leco Co.，USA）轉(zhuǎn)化成CDF格式，然后用ChromaTOF軟件對數(shù)據(jù)進行峰識別、峰對齊、基線矯正、峰面積歸一化預(yù)處理。導(dǎo)入SIMCA-P 11.5軟件進行多維分析。在本實驗中采用正交偏最小方差判別分析（OPLS-DA）模型區(qū)別各組代謝物差異。結(jié)合評價OPLS-DA 模型質(zhì)量的3 個 關(guān) 鍵 指 標(biāo)（R2X，概 括X 矩 陣 結(jié) 實 率；R2Ycum，反映模型 的 穩(wěn) 定 性；Q2Ycum 反 映 模 型 的預(yù) 測 性；其 中R2Ycum 和Q2Ycum 越 接 近1說 明 模型的穩(wěn)定性和預(yù)測性越好）及根據(jù)OPLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值（VIP，variable importance in the projection）找到潛在的代謝差異物（其VIP＞1）。實驗中采用了t 檢驗，以驗證多維統(tǒng)計中得到的差異物是否具有顯著差異［10］。搜索數(shù)據(jù)庫為NIST數(shù)據(jù)庫。

1.6 羽扇豆醇對MCF-7細胞周期的影響

為了進一步確認羽扇豆醇對MCF-7細胞的抑制作用，并且為全面闡述羽扇豆醇抑制MCF-7細胞的作用機理，本實驗進行了細胞周期實驗。

取一皿對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔板中，使得每孔有3×105個細胞。培養(yǎng)12 h后，分別加入25μg／mL和50μg／mL羽扇豆醇，作用24 h。24 h后，加入胰蛋白酶消化細胞至細胞可以用移液管或槍頭輕輕吹打下來時，輕輕吹散細胞，將其收集到離心管內(nèi)。于約1 000 g離心力下離心3～5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液，殘留約50μL左右的培養(yǎng)液以避免吸走細胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清液，殘留約50μL左右的PBS緩沖液以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管以適當(dāng)分散細胞以避免細胞成團。

細胞固定：加入1 mL預(yù)冷至4℃的70%（v／v）乙醇水溶液，輕輕吹打混勻。固定12 h后于1 000 g左右離心力下離心3～5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液，殘留約50μL 左右的70%乙醇，以避免吸走細胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清液，輕輕彈擊離心管以適當(dāng)分散細胞，避免細胞成團。

染色后進行流式細胞檢測和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 羽扇豆醇對乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用

圖1為5個濃度梯度的羽扇豆醇和3個作用時間對乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響。由圖1可以明顯地看出，在羽扇豆醇作用時間為24 h，作用濃度為10和25μg／mL時，抑制率低于10%，對MCF-7細胞沒有明顯的抑制作用。而當(dāng)羽扇豆醇的濃度增加到50μg／mL 以上時，抑制率明顯上升，均在70%以上，并且50、100和200μg／mL 羽扇豆醇的抑制作用沒有明顯的差異。當(dāng)作用時間增加到48和72 h時，抑制作用更加明顯，且高濃度的抑制效果好于低濃度。實驗結(jié)果說明，羽扇豆醇對乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用不僅有時間依賴性，也具有濃度依賴性。與文獻［11，12］報道的羽扇豆醇對乳腺癌細胞有抑制作用的研究結(jié)果一致。

圖1 羽扇豆醇濃度及作用時間對MCF-7細胞增殖的影響Fig.1 Inhibition effects of lupeol with different concentrations and reaction times on the proliferation of MCF-7 cells

2.2 基于GC-TOF／MS技術(shù)的細胞代謝組學(xué)分析

MTT實驗結(jié)果顯示，當(dāng)羽扇豆醇的作用濃度高于25μg／mL時，對MCF-7細胞的抑制率基本都在70%以上。由于細胞代謝組學(xué)使用的代謝物均為活細胞的代謝物，因此選擇羽扇豆醇作用濃度和作用時間時不僅要考慮其對MCF-7細胞的抑制作用，還要考慮保持MCF-7細胞的低致死率，因此最終選擇羽扇豆醇的作用濃度和作用時間分別為10 μg／mL和24 h。以前述甲醇-水混合液與三氯甲烷的5∶1（v／v）混合液為提取液，液液萃取提取細胞代謝物，經(jīng)硅烷衍生化后利用GC-MS 技術(shù)分析細胞代謝物。圖2為其中典型的MCF-7細胞對照組和羽扇豆醇24 h作用組的GC-TOF／MS代謝物譜圖，在S／N＝10時，MCF-7細胞的代謝譜圖的分子特 征峰個數(shù)在500～600之間。

圖2 MCF-7細胞對照組和10μg／mL羽扇豆醇作用24 h干預(yù)組代謝物的GC-TOF／MS基峰色譜圖Fig.2 Typical GC-TOF／MS base peak chromatograms of metabolite profiles of control MCF-7 cells and10μg／mL lupeol treated MCF-7 cells for 24 h

羽扇豆醇分別作用于MCF-7細胞6、12和24 h后，在上述優(yōu)化的色譜條件下，分別對細胞樣品進行分析，采集GC-TOF／MS 數(shù)據(jù)并進行多維統(tǒng)計處理。

考慮到干擾因素的復(fù)雜性，為了消除非藥物作用的影響，最大化組間分離，并尋找各組間的差異代謝物，利用有監(jiān)督的OPLS-DA 方法去除與樣品分類無關(guān)的信息，對不同時間點樣本的細胞代謝全譜進行分析。圖3 顯示的是GC-TOF／MS 細胞代謝物全譜數(shù)據(jù)的OPLS-DA 得分圖，該模型包含4 個主成分，R2Ycum＝0.988，Q2Ycum＝0.964，說 明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測率較高；且得分圖顯示對照組與給藥組樣本能明顯區(qū)分，作用24 h的差異物區(qū)別最大。

圖3 人乳腺癌細胞MCF-7代謝物的OPLS-DA 分類圖Fig.3 OPLS-DA results of metabolites of MCF-7 breast cancer cells

VIP值是OPLS-DA 有監(jiān)督性分析方法中評價變量貢獻的最常用方法，根據(jù)VIP＞1.0和p 值＜0.05（t-test），通過NIST 和標(biāo)準(zhǔn)庫，對一些具有顯著性差異的物質(zhì)進行了初步的結(jié)構(gòu)鑒別。本實驗單獨將差異性最大的對照組和羽扇豆醇24 h作用組兩組進行OPLS-DA 模型分析，獲得了11種細胞代謝差異物（見表1）。

在腫瘤細胞代謝物中，丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、琥珀酸、甘露糖和核糖醇的含量下降。亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和磷酸的含量上升。琥珀酸的含量下降、磷酸的含量上升可能是羽扇豆醇破壞了MCF-7細胞能量代謝途徑三羧酸循環(huán)造成的［13］。亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺均可以通過轉(zhuǎn)氨作用脫掉α-氨基生成有機酸類物質(zhì)，再通過分解代謝作用而生成三羧酸循環(huán)的底物，作為能量的來源［14］。也有可能是三羧酸循環(huán)受到了抑制。丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸的含量下降，可能是因為藥物抑制了MCF-7細胞的氨基酸代謝［15］。

表1 GC-TOF／MS分析人乳腺癌細胞MCF-7對照組與羽扇豆醇24 h作用組代謝差異物的鑒定結(jié)果Table 1 List of identified differential metabolites of MCF-7 breast cancer cells in lupeol 24 h treatment group as measured by GC-TOF／MS

2.3 細胞周期分析

基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，為了進一步研究羽扇豆醇作用于MCF-7細胞后的作用機制，我們考察了羽扇豆醇對MCF-7細胞周期的影響。在這個實驗中，羽扇豆醇作用時間為24 h，作用濃度為25μg／mL 和50μg／mL。結(jié)果見圖4和表2。首先溶劑對于細胞幾乎沒有影響。在排除溶劑影響的前提下，羽扇豆醇主要將細胞抑制在細胞周期的G1期（synthesis）。羽扇豆醇作用濃度為25μg／mL 和50μg／mL 時，G1期細胞所占比例從50.92%分別增長到61.69%和63.61%。同時S 期的細胞數(shù)量顯著下降，推測可能是由于羽扇豆醇抑制了MCF-7細胞中蛋白質(zhì)和能量的合成，從而使得停留在G1 期的細胞數(shù)量上升，S期的數(shù)量下降［16］。

圖4 羽扇豆醇作用于MCF-7細胞24 h的細胞周期圖Fig.4 Distributions of cellular DNA in control MCF-7 cells and lupeol treated MCF-7 cells for 24 h，determined by FCM （flow cytometry）and the occupation of cell phase in all cells

2.4 代謝差異物及作用機理推測

G1期細胞內(nèi)進行著一系列極為復(fù)雜的生物合成變化，如合成各種核糖核酸（RNA）及核蛋白體，這些物質(zhì)的形成導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白的形成，為S期DNA 的復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)和能量［17］。羽扇豆醇將細胞阻滯在G1期，所以推測羽扇豆醇的作用機理可能與能量和蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。

琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物［18］，它的含量下降，磷酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺的含量上升，均可能是因為三羧酸循環(huán)受到了抑制。三羧酸循環(huán)是機體獲得能量的主要方式，是機體將糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式。在琥珀酸硫激酶（succinatethiokinase）的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯鍵水解，釋放的自由能用于合成三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP），再生成ATP，作為能量的來源。羽扇豆醇可能抑制了琥珀酸硫激酶的活性而使得底物磷酸化的反應(yīng)受到抑制，磷酸的含量上升。而琥珀酸脫氫酶的活性受到抑制后，琥珀酸的含量下降。

綜合分析，羽扇豆醇主要抑制了細胞中的能量代謝途徑三羧酸循環(huán)，使得細胞在G1 期不能夠充分地準(zhǔn)備S 期進行DNA 復(fù)制所需要的能量和物質(zhì)，從而使得G1期細胞數(shù)量大量上升，S期細胞數(shù)量急劇下降。

3 結(jié)論

本文以GC-MS技術(shù)為平臺，通過多元統(tǒng)計分析等手段探索了羽扇豆醇作用于MCF-7細胞后細胞代謝物的變化，結(jié)果表明加藥組和未加藥組存在顯著的差異。對具有顯著性差異的物質(zhì)進行分析，得到了L-丙氨酸、磷酸等11 種代謝差異物。并結(jié)合羽扇豆醇將MCF-7 細胞抑制在G1 期的細胞周期實驗結(jié)果，推測羽扇豆醇主要通過抑制三羧酸循環(huán)代謝途徑中琥珀酰輔酶A 的生成和底物磷酸化生成ATP的反應(yīng)來抑制MCF-7細胞的增殖。

本研究利用代謝組學(xué)的方法研究中藥活性物質(zhì)作用于細胞的生物化學(xué)變化，并且與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果相聯(lián)系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

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