劉 洋， 鐘 華， 劉智峰， 蔣勇兵， 談 菲， 曾光明， 賴(lài)明勇， 何益斌

（1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410082；2.環(huán)境生物學(xué)與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖南大學(xué)），湖南 長(zhǎng)沙410082）

生物表面活性劑是由生物活體如微生物、植物或動(dòng)物產(chǎn)生的具有表面活性的兩親性化合物，具有表面活性劑的通性，如在兩相界面定向排列形成分子層，能降低界面的能量以及具有表面或界面活性、增溶、潤(rùn)濕、乳化、發(fā)泡等性能［1］。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑還具有諸多優(yōu)勢(shì)，如低毒性、可降解性和環(huán)境友好性、高效性、能用于特殊領(lǐng)域等［2-4］。

能產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物種類(lèi)很多，常見(jiàn)的有細(xì)菌、酵母菌。由微生物產(chǎn)生的胞外型生物表面活性劑大部分都屬于糖脂類(lèi)，此類(lèi)化合物以糖為親水基團(tuán)，脂肪酸或羥基脂肪酸的烷基部分為親油基團(tuán)。鼠李糖脂是目前所知的最有效的糖脂類(lèi)生物表面活性劑［5，6］，其產(chǎn)生菌多為假單胞菌屬［7］。

然而，在一般的生產(chǎn)過(guò)程中生物表面活性劑濃度很低，且親水親油的特性造成其提取和純化的成本較高，所以目前生物表面活性劑的大規(guī)模生產(chǎn)并沒(méi)有完全實(shí)現(xiàn)，而選擇合適的分離提純方法是保證其生產(chǎn)工藝成功的重要環(huán)節(jié)［8］。常見(jiàn)的鼠李糖脂提取純化的方法包括酸沉降［9，10］、溶劑萃?。?1，12］、硫酸鋁沉淀［13］和泡沫色譜法［14］等。隨著研究的不斷深入，離心分配色譜法［15］、超濾［16，17］和離子交換色 譜法［18］等新方法也已出現(xiàn)。而糖脂類(lèi)物質(zhì)的成分鑒定方法則從簡(jiǎn)易的利用鼠李糖脂水解后測(cè)定鼠李糖的色度［19］逐漸發(fā)展為利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［20］、紅外 光 譜［21］、核 磁 共 振［22］以 及 毛 細(xì) 管 電 泳法［23］等分析樣品組成的復(fù)雜方法，且有文獻(xiàn)［24，25］指出，高效液相色譜法是目前對(duì)鼠李糖脂成分識(shí)別的最精確的方法。Nitschke等［26］曾用銅綠假單胞菌LBI進(jìn)行培養(yǎng)，利用酸沉降的方法成功分離了鼠李糖脂；Mata-Sandoval等［27］則利用高效液相色譜法分析得到了由銅綠假單胞菌UG2所產(chǎn)生的鼠李糖脂的主要組成為RhC10C10、Rh2C10C12-H2、Rh2C10C12和Rh2C10C10。

本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)好氧發(fā)酵培養(yǎng)Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93066產(chǎn)生生物表面活性劑鼠李糖脂，利用酸沉降和柱色譜結(jié)合的方法對(duì)發(fā)酵液中的目標(biāo)物進(jìn)行深度純化，并對(duì)其成分進(jìn)行鑒定和表征，證實(shí)酸沉降-柱色譜方法對(duì)于鼠李糖脂的深度提純有較好的效果，而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用能夠高準(zhǔn)確性地對(duì)鼠李糖脂成分進(jìn)行識(shí)別和定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

鼠李糖脂的產(chǎn)生菌為銅綠假單胞菌CCTCC AB93066，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，中國(guó)武漢）。該菌在冷凍干燥的脫脂奶粉上于-20℃保藏。發(fā)酵培養(yǎng)前接種物由保藏基質(zhì)轉(zhuǎn)移到新鮮斜面上并于37 ℃活化24 h。

1.2 儀器與試劑

美國(guó)Thermo Finnigan 高效液相色譜分析系統(tǒng)，配Finnigan LCQ 質(zhì)譜系統(tǒng)；微孔濾膜0.22μm Millex-HV 系列（Millipore Products，美國(guó)）。

用于鼠李糖脂衍生的2-溴代苯乙酮和三乙胺純度＞99%，購(gòu)于Sigma-Aldrich（美國(guó)）。硅膠HG／T2354-92購(gòu)于青島海洋化學(xué)品公司。其他試劑均為分析純。水由Lanconco Water Pro PS 純水機(jī)（美國(guó)）制取，電阻率18.2 MΩ·cm。

1.3 鼠李糖脂的產(chǎn)生

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM 溶液）中各物質(zhì)及其質(zhì)量分 數(shù) 如 下：NaNO3（0.20%）、KH2PO4（0.15%）、Na2HPO4·12H2O （0.15%）、MgSO4（0.01%）、FeSO4·7H2O（0.001%），pH6.5［28］。菌體接種到含有酵母浸出膏（0.05%）的MSM 溶液中，在37℃、200 r／min條件下振蕩培養(yǎng)24 h作為富集培養(yǎng)基；再按2.5%的接種量接種到含2.0%葡萄糖的MSM 溶液中，在（37±1）℃、200 r／min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h，得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液。

1.4 分離和純化

用2 mol／L NaOH 溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 至8.0，在10 733 g離心力條件下離心15 min后收集上清液。鼠李糖脂的分離采用Nitschke等［26］的酸沉降方法，而提純則采用Zhong等［29］的柱色譜法，并略微修改。用6 mol／L HCl調(diào)節(jié)上清液pH 至2.0，在4 ℃下靜置過(guò)夜；然后于10 733 g離心力下離心15 min，收集底物；用去離子水洗滌3 次并冷凍干燥，得到粗鼠李糖脂混合物。將粗鼠李糖脂溶于氯仿，真空抽濾除去蛋白質(zhì)等不溶雜質(zhì)后用柱色譜方法進(jìn)行純化。柱色譜填充物選用傅海燕等［30］報(bào)道的對(duì)糖脂類(lèi)生物表面活性劑分離性能較優(yōu)的薄層色譜硅膠（HG／T2354-92，200目；青島海洋化學(xué)品有限公司）。硅膠在105 ℃活化24 h后采用濕法裝柱，將氯仿溶液與活化后的硅膠混合引流入玻璃柱（320 mm×25 mm）中，并注意排盡殘留氣泡。將粗鼠李糖脂的氯仿溶液小心沿色譜柱內(nèi)壁壁周注入色譜柱的頂部，打開(kāi)柱閥，使鼠李糖脂吸附到頂部硅膠上。采用500 mL的氯仿對(duì)硅膠柱淋洗以除去鼠李糖脂中的中性脂，然后依次用100 mL（10∶1，v／v）、200 mL（2∶1，v／v）、100 mL（1∶1，v／v）和200 mL（1∶2，v／v）的氯仿和甲醇混合液進(jìn)行梯度洗脫（甲醇用于逐步提高淋洗液的極性，從而達(dá)到單糖脂和二糖脂分離的目的），淋洗液的流速控制在2 mL／min，定量收集淋洗液。采用薄層色譜（TLC）對(duì)溶液成分進(jìn)行鑒定，用硅膠板（HF 254，青島海洋化學(xué)品公司）作為展開(kāi)板。展開(kāi)劑成分為CHCl3／CH3OH／CH3COOH（65／15／2，v／v／v），莫氏試劑作為顯色劑［31］。鼠李糖脂的單糖脂和二糖脂洗出液分別合并后于40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到單糖脂和二糖脂產(chǎn)品，并做進(jìn)一步定性分析。

1.5 HPLC-MS鑒定

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)提純的鼠李糖脂的單糖脂、二糖脂及其2-溴代苯乙酮衍生物進(jìn)行成分分析，參考Mata-Sandoval等［27］所用方法并略微修改。未衍生的鼠李糖脂樣品在60 ℃下烘干后溶于乙腈，配成約10 g／L的溶液，用0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾后取20μL濾液注入液相色譜儀。

色譜柱為Inertsil ODS-3 柱（C18，150 mm×2.1 mm，5μm，日本GL Sciences公司）。流動(dòng)相由流 動(dòng) 相A（CH3CN）和 流 動(dòng) 相B（1% （v／v）CH3COOH 的水溶液）構(gòu)成。梯度洗脫條件：0～3 min，50%B；3～12 min，50%B～0%B；12～16 min，0%B；16～17 min，0%B～50%B；17～20 min，50%B。流 速0.4 mL／min，進(jìn) 樣 體 積 為20μL。

HPLC 流出液直接進(jìn)入Finnigan LCQ 質(zhì)譜系統(tǒng)，以大氣壓化學(xué)電離（APCI）作為離子源。對(duì)于鼠李糖脂樣品采用負(fù)離子模式；對(duì)于鼠李糖脂衍生物樣品采用正離子模式。噴霧電壓4.5 kV，N2為套氣，F(xiàn)innigan Xcalibur系統(tǒng)用于數(shù)據(jù)采集。

單糖脂和二糖脂主要成分的物質(zhì)的量百分比由各成分出峰面積的比例近似計(jì)算得到。

1.6 鼠李糖脂二糖脂的二次純化過(guò)程

將獲得的二糖脂固體溶于氯仿后，再次注入柱色譜的頂部。用300 mL氯仿／甲醇（10∶1，v／v）混合液以2 mL／min的速度淋洗柱，每10 mL淋洗液收集一試管。用薄層色譜按1.4節(jié)中的方法鑒定淋洗液，收集含有鼠李糖脂二糖脂的淋洗液。收集的淋洗液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的二糖脂固體產(chǎn)物用HPLC-MS方法再次鑒定，樣品在乙腈中的質(zhì)量濃度約為50 g／L。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠李糖脂的分離和純化

由于鼠李糖脂分子具有極性，易與極性的硅膠結(jié)合，所以使用氯仿淋洗除去粗鼠李糖脂中弱極性的中性脂等雜質(zhì)時(shí)，鼠李糖脂不會(huì)被極性很弱的氯仿洗脫。鼠李糖脂的分離和純化則是利用二糖脂的極性大于單糖脂的特征，用氯仿和甲醇混合液進(jìn)行梯度洗脫，從而達(dá)到單糖脂和二糖脂分離的目的。圖1為一次柱色譜后鼠李糖脂收集管中液體的TLC 顯色結(jié)果。目標(biāo)物隨展開(kāi)劑的遷移性能通過(guò)比移值（Rf）［32］反映：?jiǎn)翁侵腞f，mono為0.89，二糖脂的Rf，di為0.71，表明單糖脂相對(duì)二糖脂隨展開(kāi)劑的遷移性能更強(qiáng)，這是由于單糖脂與極性硅膠之間的吸附系數(shù)小于二糖脂所致。

圖1 鼠李糖脂成分的薄層色譜檢測(cè)結(jié)果Fig.1 TLC detection of the purified rhamnolipids

2.2 鼠李糖脂的HPLC-MS鑒定

在RhaxCyCz（-Hw）中，x 為鼠李糖環(huán)的數(shù)目（單糖脂x＝1），y 和z 為脂基部分每個(gè)脂肪酸鏈中的碳原子的個(gè)數(shù)，w／2 為脂基部分不飽和鍵的個(gè)數(shù)。

鼠李糖脂的單糖脂混合物外觀上呈棕色黏稠油狀。HPLC-MS色譜圖顯示分離、純化得到的鼠李糖脂的單糖脂含有5種成分，其中主要成分有3種，分別在12.5～13 min、14～14.5 min和15～15.5 min被分離，產(chǎn)生的最強(qiáng)負(fù)離子APCI質(zhì)譜信號(hào)分別為m／z 1 006.9、529.1和531.1（見(jiàn)圖2）。根據(jù)其他銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鼠李糖脂成分的研究結(jié)果［27，31，33］，以 上3 種 成 分 分 別 為RhaC10C10、RhaC10C12-H2和RhaC10C12。m／z 1 006.9 據(jù)推斷是由RhaC10C10的二聚體負(fù)離子產(chǎn)生。從圖2中可以看出，該混合物主要成分為RhaC10C10。根據(jù)以往研究結(jié)果［27，31，33］，在10.00 min和11.75 min時(shí)出峰的物質(zhì)有可能是脂肪鏈更短的鼠李糖脂單糖脂成分（如RhaC10C8），但含量很低。

鼠李糖脂的單糖脂衍生物的HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，衍生物各成分的流出順序和其源成分一致，各成 分 最 強(qiáng) 正 離 子 分 別 為m／z 640.1、665.9 和668.0，［M-苯甲酰甲酯＋NH＋4］（見(jiàn)圖3）。該結(jié)果與Schenk等［13］和Mata-Sandoval等［27］關(guān)于鼠李糖脂的苯甲酰甲酯衍生物的NMR 和HPLC-MS研究結(jié)果一致。

第一次柱色譜純化得到的鼠李糖脂二糖脂混合物呈白色微黃的晶體狀。HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果表明其有4種主要成分，分別在10.5～11.0 min、12.0～12.5 min、12.5～13.0 min 和13.0～13.5 min被分離，產(chǎn)生的最強(qiáng)負(fù)離子APCI質(zhì)譜信號(hào)分別為m／z 649.1、675.0、503.0和677.1（見(jiàn)圖4）。

圖2 鼠李糖脂單糖脂的HPLC-MS圖譜Fig.2 Chromatogram and spectra of HPLC-MS of the monorhamnolipid

圖3 鼠李糖脂單糖脂衍生物的HPLC-MS圖譜Fig.3 Chromatogram and spectra of HPLC-MS of the derivatives of the monorhamnolipid

圖4 第一次柱色譜純化后得到的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS圖譜Fig.4 Chromatogram and spectra of HPLC-MS of dirhamnolipid after the first-round separation by column chromatography

該結(jié)果也與以往得到的其他銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鼠李糖脂成分研究結(jié)果［27，31，33］保持一致，以上4種成分分別為Rha2C10C10、Rha2C10C12-H2、RhaC10C10和Rha2C10C12。在分離得到的二糖脂中，均含有少量的RhaC10C10單糖脂成分，其未被硅膠柱一次淋洗完全分離，也沒(méi)有被TLC 所檢出，這可能是由于色譜柱中所加入的待分離和純化的鼠李糖脂量太大所致。在圖4中推斷6.5～7.2 min時(shí)出峰的是脂肪鏈更短的二糖脂成分，但含量很低，其他保留時(shí)間所出的信號(hào)峰可能為柱色譜未能完全分離的雜質(zhì)所產(chǎn)生。

如圖5所示，鼠李糖脂二糖脂衍生物的HPLCMS檢測(cè)結(jié)果表明，衍生物各成分的洗出順序和其源成分一致，各二糖脂成分最強(qiáng)正離子［M-苯甲酰甲 基＋NH＋4］m／z 分 別 約 為786.1、812.2 和814.2，而單糖脂成分最強(qiáng)正離子為［M-苯甲酰甲酯＋（CH3CH2）3NH＋］（m／z 723.9）或［M-苯甲酰甲基＋NH＋4］（m／z 640）。這證實(shí)了混合物中少量單糖脂成分的存在。

2.3 鼠李糖脂二糖脂的二次純化

圖6為經(jīng)過(guò)二次柱色譜純化的鼠李糖脂二糖脂HPLC-MS圖譜。由于進(jìn)樣所用的二糖脂的質(zhì)量濃度很高（約50 mg／L），導(dǎo)致圖譜中峰面積普遍變大，甚至超過(guò)了線(xiàn)性檢測(cè)范圍，使得各物質(zhì)峰面積的比例和一次色譜后鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果不一致，但出峰時(shí)間是一致的。圖6中10.69、12.24和13.35 min出峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)（m／z 649.0、675.0和677.0）分別為Rha2C10C10、Rha2C10C12-H2和Rha2C10C12，共3種成分。

比較二次純化前后的圖譜可以看出，圖6中已沒(méi)有圖4 中對(duì)應(yīng)RhaC10C10的峰，表明該單糖脂成分通過(guò)二次柱色譜已完全從二糖脂中除去。另外7.0～7.7 min時(shí)出峰與圖4中6.5～7.2 min時(shí)的出峰對(duì)應(yīng)（m／z 621.1），為［Rha2C10C8-H］-，對(duì)應(yīng)的二糖脂成分為Rha2C10C8；9.5～10.0 min時(shí)出峰與圖4 中10.5～11.0 min時(shí)的出峰對(duì)應(yīng)（m／z 647.1），對(duì)應(yīng)二糖脂成分為Rha2C10C10-H2。由于一次提純的二糖脂進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)時(shí)采用的質(zhì)量濃度較?。?0 mg／L），這兩種成分對(duì)應(yīng)的峰特別小或者未被檢測(cè)到，說(shuō)明這兩種成分的含量相對(duì)很低。14.5～15.0 min出峰物質(zhì)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，由于其存在于二糖脂的色譜圖之中，僅就其質(zhì)譜圖難以判斷是何種成分，推測(cè)有可能為二糖脂分子與乙腈溶劑反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，也有可能是細(xì)胞產(chǎn)生的與二糖脂結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近的而未被分離的雜質(zhì)，該物質(zhì)的柱色譜分離條件有待進(jìn)一步探討。

圖5 第一次柱色譜純化后得到的鼠李糖脂二糖脂衍生物的HPLC-MS圖譜Fig.5 Chromatogram and spectra of HPLC-MS of the derivatives of dirhamnolipid after the first-round separation by column chromatography

圖6 第二次柱色譜純化后得到的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS圖譜Fig.6 Chromatogram and spectra of HPLC-MS of the dirhamnolipid after the second round purification by column chromatography

圖7 第二次柱色譜純化后的鼠李糖脂二糖脂的HPLC-MS圖譜中出峰時(shí)間為14.5～15.0 min的物質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of the compound at the retention time of 14.5-15.0 min in HPLC-MS chromatogram of the dirhamnolipid after the secondround purification by column chromatography

由于二糖脂分子中多一個(gè)鼠李吡喃糖環(huán)，因而比單糖脂具有更大的極性，在單糖脂之后由甲醇含量高、極性更強(qiáng)的甲醇／氯仿混合溶劑洗脫。另外單糖脂和二糖脂的熔點(diǎn)分別為-3.2 ℃和84.7℃［34］，因此外觀上單糖脂為油狀，二糖脂混合物為固體狀。兩種鼠李糖脂的主要成分為Rha（2）C10C10，與 其 他 研 究［27，31，33］的 結(jié) 果 相 同，但 其 中Rha（2）C10C8系列的短脂肪鏈成分含量相對(duì)其他研究結(jié)果均較低，而兩種疏 水性成分Rha（2）C10C12和Rha（2）C10C12-H2含量偏高，反映了銅綠假單胞菌種產(chǎn)鼠李糖脂性能受菌株差異和培養(yǎng)條件的影響［35］。最終得到的鼠李糖脂單糖脂和二糖脂的主要成分及其組成如表1所示。

表1 由銅綠假單胞菌CCTCC AB93066獲得的鼠李糖脂單糖脂和二糖脂的主要成分Table 1 Main components of the monorhamnolipid and dirhamnolipid obtained from Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB93066

3 結(jié)論

本研究中所用的鼠李糖脂的單糖脂和二糖脂混合物為銅綠假單胞菌CCTCC AB93066 的代謝產(chǎn)物，均為多成分混合物。在鼠李糖脂的分離提純過(guò)程中采用的酸沉降-柱色譜技術(shù)可以用于鼠李糖脂的深度提純，對(duì)高效液相色譜-質(zhì)譜的結(jié)果進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂的深度提純獲得了較好的效果，且高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)物質(zhì)成分鑒定和定量分析有靈敏度高和準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種可靠的檢測(cè)方法。該研究同時(shí)也說(shuō)明了銅綠假單胞菌CCTCC AB93066是一種良好的鼠李糖脂產(chǎn)生菌。

致謝 感謝湖南大學(xué)分析與測(cè)試中心的宋又群老師在鼠李糖脂HPLC-MS分析測(cè)定工作中給予的支持與幫助。

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