劉芳

(北京市昌平區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，北京 102200)

近年來，檸檬黃、日落黃等色素超標(biāo)而導(dǎo)致食品被禁止銷售在國內(nèi)外屢次出現(xiàn)，成為食品不合格的重要因素之一。合成色素有一定毒性，食用過多會危害人體健康［1］。我國衛(wèi)生部發(fā)布的GB 2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定糕點中不得檢出檸檬黃、日落黃［2］。

目前，國標(biāo)方法［3］的樣品處理步驟較為繁瑣，所用試劑有強烈的刺激性氣味，而且糕點樣品的抽濾通常十分困難，同時國標(biāo)方法采用的流動相和測定波長容易使目標(biāo)峰受到雜質(zhì)干擾。通過查閱資料及多次分析實驗，采用水浴浸提的方法提取糕點中的檸檬黃、日落黃，采用離心取上清液的方法凈化樣品［4］，并改變了流動相的梯度淋洗比例和測定波長，簡化了分析步驟，避免了雜質(zhì)干擾，提高了檢測靈敏度，獲得了較為滿意的回收率。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國安捷倫公司；

快速混勻器：GL-88B型，海門麒麟醫(yī)用儀器廠；

恒溫水浴鍋：XMTD-4000型，北京君豪科技發(fā)展有限公司；

高速離心機：3K30型，博勵行儀器有限公司；

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW(E) 100001a］：500 mg／L，中國計量科學(xué)研究院；

日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW(E) 100003a］：500 mg／L，中國計量科學(xué)研究院；

甲醇：色譜純，美國Fisher Scientifi c公司；

乙酸銨：分析純，廣東汕頭市西隴化工廠；

實驗室用水經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)純化。

1.2 色譜條件：

色 譜 柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；紫外檢測器；檢測波長：檸檬黃為430 nm,日落黃為482 nm；柱溫：40℃；流動相：A為甲醇，B為0.02 mol／L乙酸銨溶液，流量為1.0 mL／min；梯度洗脫程序：0～7 min時15% A+85% B，7～14 min時40% A+60% B，14～16 min時15% A+85% B；進(jìn)樣量：10 μL；

1.3 實驗方法

稱取5.00 g粉碎均勻的樣品于100 mL比色管中，加入50 mL水，于快速混勻器中渦旋混勻，然后于60℃水浴1 h，期間顛倒混勻幾次，浸泡放置過夜，取上清液以4 000 r／min離心5 min，用帶針注射器吸取上清液供測定。以標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。

1.4 色譜圖

按照1.2色譜條件測定樣品溶液，色譜圖見圖1。由圖1可知，在改變了流動相梯度淋洗比例和變換測定波長后，延緩了目標(biāo)峰的出峰時間，可避免樣品中雜質(zhì)峰的干擾，有較高的靈敏度。

圖1 檸檬黃、日落黃樣品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法

使用高效液相色譜儀測定食品中的著色劑，國家標(biāo)準(zhǔn)方法中的聚酰胺吸附法［3］依據(jù)水溶性酸性色素在酸性條件下被聚酰胺吸附，然后在堿性條件下解吸附［5］，但利用甲醇-甲酸(60∶40)的混合液洗脫天然色素和其它雜質(zhì)時會造成合成著色劑損失，而且糕點樣品在使用G3垂融漏斗抽濾時通常十分困難。筆者曾采用乙醇-氨水直接提取色素或用濾紙及布氏漏斗代替G3垂融漏斗等多種方法嘗試，均未得到滿意結(jié)果。通過查閱資料及多次分析實驗，依據(jù)檸檬黃、日落黃為水溶性色素，與其它溶劑相比它們在水中的溶解度最大［6］，且其溶解度隨溫度升高而增大，二者耐熱性較強［7］，參考國標(biāo)方法的水浴溫度，采用水浴浸提的方法提取糕點中的檸檬黃、日落黃，得到滿意效果。

由于糕點成分復(fù)雜，加標(biāo)后的樣品有的很容易就可以將色素提取到水中，如月餅、麻花；而有的樣品則較困難，如面包、餅干；但經(jīng)過渦漩混勻、水浴加熱及浸泡過夜后，均可獲得較高的回收率。實驗發(fā)現(xiàn)用0.45 μm濾膜過濾會造成色素較大損失，所以采用離心的方法，取上清液測試［4］，雖然溶液下層殘渣中仍有少量著色劑吸附，但和用0.45 μm濾膜過濾相比損失較小。離心可以使雜質(zhì)等顆粒物質(zhì)沉淀，盡可能達(dá)到去除此類物質(zhì)的目的。離心后，糕點中的油脂會漂浮于液面上層，這一小部分油脂對于檢測沒有太大影響，但對色譜柱污染較大，如果使用吸附劑或?qū)游鎏盍蟿t會造成著色劑提取損失，所以使用一次性帶針注射器穿過油脂吸取中間水層，這樣可使油脂的殘留很小。

如果浸提用水偏酸性，則有可能產(chǎn)生色素酸沉淀，給檢測帶來影響，所以提取過程中使用中性水。

2.2 儀器條件優(yōu)化

國家標(biāo)準(zhǔn)方法所采用的254 nm波長雖然能夠同時對多種色素進(jìn)行測定，但是干擾物質(zhì)較多，尤其檸檬黃出峰時間較早，易與樣品干擾峰疊加。所以改變甲醇、乙酸銨溶液的梯度淋洗比例，并采用檸檬黃、日落黃有最大吸收波長的430 nm和482 nm［7-8］測定。

2.3 線性方程與檢出限

分別準(zhǔn)確吸取500 mg／L檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.5，1.0，2.0，4.0 mL，用水定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg／L的檸檬黃、日落黃系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件測定，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得檸檬黃線性方程為Y=31.067X+4.848 2，r2=0.999 7，日落黃線性方程為Y=32.01 9X+0.829 7，r2=0.999 9。

按3倍信噪比計算檢出限，得到檸檬黃檢出限為0.4 mg／kg，日落黃檢出限為0.3 mg／kg。

2.4 精密度試驗

取同一批樣品加入標(biāo)檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)混合液，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果

由表1可知，檸檬黃、日落黃測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.8%，3.7%，說明方法的精密度良好。

2.5 回收試驗

吸取適量檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液加入糕點樣品中，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，檸檬黃的回收率為72.5%～77.2%，日落黃的回收率為73.2%～82.0%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了糕點中檸檬黃、日落黃的高效液相色譜分析方法。本方法樣品處理簡單，避免了雜質(zhì)干擾，提高了靈敏度，可以滿足糕點中檸檬黃、日落黃的測定要求。

［1］米爾芳，王彩云，趙霞，等.可見光區(qū)多種波長梯度洗脫同時測定六種色素的方法研究［J］.實用醫(yī)技雜志，2009，16(6): 489-490.

［2］GB 2760-2011 糕點中檸檬黃、日落黃的限量［S］.

［3］GB／T 5009.35-2003 食品中合成著色劑的測定［S］.

［4］鄢兵，龍洲雄，萬春花，等. HPLC法同時測定飲料中檸檬黃和日落黃［J］.現(xiàn)代測量與實驗室管理，2007(4): 14-14.

［5］徐春祥，王峰，趙維佳.高效液相色譜法測定火腿腸中的誘惑紅［J］.化學(xué)分析計量，2005，14(1): 12-13，55.

［6］管敏婭，張立義.食品中5種合成食用色素高效液相色譜檢測方法的探討［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(6): 1 105-1 106.

［7］馮慧，梅利華，謝繼安.高效液相色譜檢測蜜餞中合成色素的最佳測定波長研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2007(9): 39-41.

［8］程小會，鄧敬頌.液相色譜法測定果蔬汁中檸檬黃和日落黃方法優(yōu)化［J］.化學(xué)分析計量，2010，19(2): 70-71.