劉雅輝， 王秀萍， 魯雪林， 張國新， 李九歡， 李 強

(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 曹妃甸063200)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫因子。中國的鹽漬土近1×108hm2，且鹽漬化和次生鹽漬化不斷擴大，鹽漬化土壤結(jié)構(gòu)極差，作物難以正常生長，嚴重影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此合理開發(fā)利用鹽堿地是一項迫在眉睫的任務。棉花是中國重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位［1-2］。在糧棉爭地矛盾日益突顯的情況下，棉花以其較好的耐鹽性，逐漸成為鹽堿地一種新的優(yōu)勢作物。目前，中國是世界上鹽堿地植棉規(guī)模最大的國家。據(jù)不完全統(tǒng)計［3］，中國植棉區(qū)內(nèi)鹽堿地約有1.7×108hm2，其中2.7×106hm2先后開發(fā)植棉。因此，選育耐鹽棉花品種是目前解決鹽堿地利用的一種有效手段。但是由于棉花的耐鹽性十分復雜［4］，耐鹽機理尚不是很清楚，這給棉花耐鹽育種帶來很大困難，目前尚缺乏可以在鹽堿地大面積推廣應用的耐鹽品種。因此開展棉花品種的耐鹽鑒定并對耐鹽種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，拓寬遺傳基礎，篩選耐鹽新基因，對于開發(fā)利用鹽漬化土壤，擴大棉花種植面積，提高單位產(chǎn)量，具有十分重要的理論價值和實際意義。

SRAP 標記是由美國加州大學蔬菜作物系Li 等［5］提出的，又稱為基于序列擴增多態(tài)性，是一種新型的基于PCR 的標記系統(tǒng)，通過獨特的引物設計對開放閱讀框進行擴增，因不同個體、物種的內(nèi)含子、啟動子及間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標記具有操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、在基因組中分布均勻、便于克隆測序目標片段、成本低廉等特點，目前已廣泛應用于各種作物的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析等方面的研究［6-9］。在棉花上，也有大量學者利用該技術(shù)進行了遺傳多樣性檢測、抗病基因的篩選等方面的研究［10-14］，但將該技術(shù)應用于棉花耐鹽性研究還未見報道。

本研究以多年收集、鑒定的黃河流域棉區(qū)具有代表性的26 份棉花耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源為試驗材料，利用SRAP 技術(shù)進行遺傳多樣性分析，了解該區(qū)域棉花耐鹽品種(品系)間遺傳差異，為有針對性的選用不同類型的耐鹽親本、聚合不同耐鹽基因和進一步提高耐鹽種質(zhì)資源的耐鹽性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所耐鹽旱作研究室多年收集、鑒定和篩選的26 份棉花耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源，具體來源見表1。SRAP 引物參照Li 等［5］公布的通用引物，共組成88 對引物，引物序列由北京華大基因研究中心合成。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽鑒定方法 按照河北省地方標準《棉花耐鹽性鑒定評價技術(shù)規(guī)范》［15］中的苗期耐鹽鑒定方法，于河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所濱?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基地進行耐鹽性試驗。試驗設2 個處理，耐鹽性處理:在池子內(nèi)填加混合均勻的土壤全鹽含量為0.4%的鹽堿原土，處理期間根據(jù)日蒸發(fā)量的大小，噴施一定量淡水，使鹽堿土含鹽量盡量保持恒定。對照:池子內(nèi)填加土壤全鹽含量為≤0.1%的土壤，試驗期間管理同耐鹽性處理。3 次重復。觀察記載植株的葉片形狀、顏色和受害癥狀，進行苗情分類，然后計算鹽害指數(shù)，鹽害指數(shù)分級標準:鹽害指數(shù)≤15.0%為1 級，極強耐鹽;15.1% ～30.0%為2 級，強耐鹽;30.1% ～60.0%為3 級，耐鹽;60.1% ～85.0% 為4 級，弱耐鹽;85.1% ～100.0%為5 級，極弱耐鹽。

1.2.2 基因組DNA 提取與檢測 利用北京康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)的CottonGenDNAkit 對供試材料進行DNA 的提取，然后用北京普析通用儀器有限責任公司生產(chǎn)的TU-1810 紫外分光光度計檢測DNA 純度與濃度。

1.2.3 PCR 擴增和產(chǎn)物檢測 PCR 反應體系為20.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，5 U/μlTaq酶0.2 μl，30 ng/μl 模板DNA 1.0 μl，50 ng/μl 正反引物各0.7 μl，PCR 染料2.0 μl，ddH2O 13.0 μl。PCR 反應在Eppendorf mastercycler gradient 基因擴增儀中進行。PCR 擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72℃延伸10 min，共5 個循環(huán)，然后將退火變?yōu)?0 ℃，在進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，觀察統(tǒng)計帶型。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 觀察PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，統(tǒng)計清晰穩(wěn)定且易于辨認的條帶。在同一基因位點上，每個樣品擴增條帶按有無記錄，擴增條帶存在時記為1，不存在時記為0。利用軟件NTSYS-pc2.1 計算各材料間Jaccard 遺傳相似性系數(shù)，并用類平均法(UPGMA)對所有材料進行聚類。

2 結(jié)果

2.1 供試材料的耐鹽鑒定

26 份材料的耐鹽鑒定結(jié)果(表1)顯示，有3 份材料表現(xiàn)為強耐鹽，4 份材料耐鹽性弱，其余都為耐鹽材料。可見大部分材料都是耐鹽材料，強耐鹽或耐鹽性弱材料各占10%左右。

2.2 SRAP 多態(tài)性引物的篩選

首先選用耐鹽差異大的2 個材料NY1 和新研96-48，對88 對引物進行篩選，40 對引物有擴增條帶，且有多態(tài)性，然后用40 對引物對所有材料進行擴增，最終有29 對引物的擴增產(chǎn)物多態(tài)性高，帶型清晰。

2.3 SRAP 多態(tài)性分析

用29 對引物組合在26 份材料中共擴增出780 個位點，多態(tài)性位點238 個，多態(tài)率達30.51%，每個引物組合的多態(tài)性位點為2 ～13 個，平均每個引物組合產(chǎn)生8.2 個多態(tài)性位點。其中，22 個強耐鹽和耐鹽材料在29 對引物中均具有多態(tài)性，多態(tài)性位點達128 個，4 個耐鹽性弱的材料在15 對引物中具有多態(tài)性，多態(tài)性位點為25 個。

2.4 遺傳相似性分析

利用軟件NTSYS-pc2.1 計算各材料間Jaccard 遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果顯示，26 個材料間的相似系數(shù)為 0.565 ～0.973，平均值0.767，分布在0.7 ～0.8 區(qū)間的占84.10%，其中自主選育的NY1 與遼棉16 的相似系數(shù)最小，為0.565，說明它們間的親緣關(guān)系較遠，遺傳差異大;中棉所35 與中棉所49 的相似系數(shù)最大，為0.973，其次是邯棉103 與邯棉5158，為0.957，說明它們之間的親緣關(guān)系較近。

22 個強耐鹽和耐鹽材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.565 ～0.973，平均值為0.782，4 個耐鹽性弱的材料的遺傳相似系數(shù)為0.733 ～0.859，均值為0.807。耐鹽(強耐鹽和耐鹽)和耐鹽性弱的材料間的遺傳相似系數(shù)大多數(shù)為0.7 ～0.8?？梢姡狙芯看蟛糠植牧系倪z傳相似系數(shù)較高。

表1 26 份材料名稱、來源及耐鹽性鑒定結(jié)果Table 1 Names，origins and salinity tolerances of 26 cotton materials

2.5 聚類分析

利用軟件NTSYS-pc2.1 用類平均法(UPGMA)對所有材料進行聚類分析，在閾值為0.72 時，26 份材料被分成3 個類群，其中第一類群只包括1 份材料(遼棉16)，第二類群包括2 份材料(枝棉3 號和NY1)，其余23 份材料聚到第三類群。第三類群又可以分為2 個亞類，第一亞類包含21 份材料，第二亞類只包含2 份材料(衡棉4 和冀豐106)。

從聚類圖還可以看出，一些耐鹽性相同的材料分布較集中，如閾值為0.8 時，第三類群的第一亞類中除了新研96-48，大多數(shù)材料均為耐鹽材料;而第二亞類中，除了魯棉17和豫棉21，均為耐鹽性弱材料。絕大部分有親緣關(guān)系的材料聚為一類，說明該分析結(jié)果和系譜分析基本吻合。

3 討論

SRAP 分子標記技術(shù)是在總結(jié)已有標記技術(shù)的優(yōu)缺點之后開發(fā)的新型標記技術(shù)，具有引物設計簡單，穩(wěn)定性強等優(yōu)點;它不需要進行SSR 那樣復雜的引物開發(fā)，降低了RFLP 標記對DNA 濃度和純度的高要求，取消了AFLP 的預擴增和連接步驟，比RAPD 更加高效，這些優(yōu)點已在各種作物的廣泛應用中得到證實。本研究結(jié)果也證明，SRAP 技術(shù)具有簡單、穩(wěn)定性高、重復性好的特點，而且條帶清晰，擴增效果良好，多態(tài)性較高，能夠較好地反映棉花耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，是研究遺傳變異的一種有效手段。

本研究利用SRAP 技術(shù)從分子水平上對中國黃河流域中早熟棉區(qū)部分陸地棉耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明多數(shù)材料的遺傳相似系數(shù)都在0.7 以上，可見本研究所選的材料間遺傳相似性較高，說明中國黃河流域中早熟棉區(qū)陸地棉耐鹽種質(zhì)資源遺傳基礎狹窄，這與前人［16-18］的研究結(jié)果具有一致性。陸地棉以外的其他栽培種、遠緣野生種及棉屬的一些野生種等材料，具有豐富的遺傳多樣性和突出的抗逆性，可能含有許多耐鹽基因［19］，因此我們要注重這些資源的搜集、引進，并合理利用這部分資源，拓寬中國棉花耐鹽種質(zhì)的遺傳基礎。從聚類圖上看，分布在不同類群的材料，由于遺傳相似系數(shù)小，遺傳差異較大，相互雜交更易發(fā)揮超親優(yōu)勢。因此在棉花耐鹽育種中盡量選擇遺傳相似系數(shù)小，耐鹽差異大的材料配置雜交組合。

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