唐 甜

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 武漢430060）

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，女性較男性發(fā)病率高。臨床發(fā)現(xiàn)的甲狀腺結(jié)節(jié)中有5%－10%為甲狀腺癌，其發(fā)病率為30－40／100萬(wàn)，占人類所有惡性腫瘤的1%－2%。其中甲狀腺乳頭狀癌（Papil－lary thyroid carcinoma，PTC）最多，占60%－80%。近年來(lái)，我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)［1］。為了使甲狀腺癌患者得到正確診斷和及時(shí)有效治療，我們需要進(jìn)一步研究和探討甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制。

RECK基因是近年發(fā)現(xiàn)的新型基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑，研究表明，其可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMP的表達(dá)，抑制腫瘤血管形成，從而抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移［2－4］。

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)RECK與MT1－MMP在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，以探討其在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中的作用機(jī)制，為臨床上治療甲狀腺乳頭狀癌提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來(lái)源

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2008－2012年手術(shù)切除及活檢的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本40例和癌旁組織20例。其中甲狀腺乳頭狀癌中男12例，女28例；年齡23－68歲。癌旁組織中男6例，女14例；年齡20－60歲。隨訪時(shí)間為8－36個(gè)月，平均隨訪時(shí)間20.3個(gè)月，中位隨訪時(shí)間18個(gè)月。

1.2 材料分組

蠟塊切片厚5μm，粘片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。常規(guī)HE染色，用免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)RECK和MT1－MMP在各組中的表達(dá)。

2.主要試劑和儀器

2.1 主要試劑

2.1.1 濃 縮 型 兔 抗 人 MT1－MMP、鼠 抗 人RECK多克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；

2.1.2 超敏即用型S－P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

2.1.3 顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

3.方法

3.1 免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)RECK和 MT1－MMP相關(guān)抗原

主要步驟：

5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫處理10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，Ezrin蛋白采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min），正常羊血清37℃孵育10min以減少非特異性反應(yīng)，一抗37℃孵育1h，生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育10min，SP復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用磷酸緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

3.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

3.2.1 以胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。

3.2.2 采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)RECK和MT1－MMP的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下RECK和MT1－MMP的陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。

（陽(yáng)性面積率＝單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率作單因素方差分析和SNK－q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.RECK的表達(dá)

甲狀腺乳頭狀癌組織內(nèi)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，RECK表達(dá)弱（圖1）；癌旁組織中可見(jiàn)密集分布的棕黃色顆粒，RECK表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖2）。圖像分析結(jié)果顯示：癌旁組織和甲狀腺乳頭狀癌組織之間RECK表達(dá)的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義（P＜0.05）（表1）。

表1 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中RECK表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area ofRECKin thyroid papillary carcinoma and inCarcinoma adjacent tissue（）

表1 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中RECK表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area ofRECKin thyroid papillary carcinoma and inCarcinoma adjacent tissue（）

▲甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織比較 （P＜0.05）▲Comparison between thyroid papillary carcinomaand Carcinoma adjacent Tissue P＜0.05

ositive area甲狀腺乳頭狀癌thyroid papillary carcinoma 40 0.0851±0.0384▲ 0.0900±0.0385組別Group例數(shù)n平均光密度Average opticaldensity陽(yáng)性面積率Rate ofp▲癌旁組織Carcinoma adjacent tissue 20 0.2758±0.0743 0.2850±0.0745

圖1 RECK在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，RECK表達(dá)弱（S－P×200）。圖2 RECK在癌旁組織中的表達(dá)可見(jiàn)密集分布的棕黃色顆粒，RECK表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（S－P×200）。Fig.1Expression ofRECKinthyroid papillary carcinoma Tere were few brown particles inthecytoplasmof thyroid papillary carcinoma，RECKwas weaklymasculine.S－P×200Fig.2Expression of RECKin Carcinoma adjacent tissueThere were plenty of brown particles in the cytoplasm ofCarcinoma adjacent tissue.RECK was Stronglymasculine.S－P×200

2.MT1－MMP的表達(dá)

甲狀腺乳頭狀癌組織內(nèi)可見(jiàn)密集分布的棕黃色顆粒，MT1－MMP表達(dá)強(qiáng)（圖3）；癌旁組織中可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，MT1－MMP表達(dá)弱（圖4）。圖像分析結(jié)果顯示：甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁組織之間MT1－MMP表達(dá)的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義（P＜0.05）（表2）。

表2 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中MT1－MMP表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MT1－MMP in thyroid papillary carcinoma and in Carcinoma adjacent tissue

表2 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中MT1－MMP表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MT1－MMP in thyroid papillary carcinoma and in Carcinoma adjacent tissue

▲甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織比較 （P＜0.05）▲comparison between thyroid papillary carcinomaand Carcinoma adjacent Tissue P＜0.05

ositive area甲狀腺乳頭狀癌thyroid papillary carcinoma 40 0.2756±0.0698▲ 0.3854±0.0701組別Group例數(shù)n平均光密度Average opticaldensity陽(yáng)性面積率Rate ofp▲癌旁組織Carcinoma adjacent tissue 20 0.0801±0.0357 0.0820±0.0359

圖3 MT1－MMP在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)可見(jiàn)密集分布的棕黃色顆粒，MT1－MMP表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（S－P×200）；圖4 MT1－MMP在癌旁組織中的表達(dá)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，MT1－MMP表達(dá)弱（S－P×200）；Fig.3Expression ofMT1－MMPin thyroid papillary carcinomaThere were plenty of brown particles in the cytoplasm ofthyroid papillary carcinoma.MT1－MMPwas Stronglymasculine.S－P×200Fig.4Expression ofMT1－MMPinCarcinoma adjacent tissue Tere were few brown particles inthecytoplasmof Carcinoma adjacent tissue，MT1－MMP was weaklymasculine.S－P×200

討 論

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的60%－70%，發(fā)病及生物學(xué)行為較為特殊，甲狀腺癌（TC）在頭頸部腫瘤中居首位。病理組織學(xué)改變有時(shí)和某些具有顯著的假乳頭結(jié)構(gòu)的良性乳頭狀增生性疾病不易鑒別，影響臨床診斷和治療［5，6］。盡管大多數(shù)PTC患者表現(xiàn)為無(wú)痛性甲狀腺腫塊，治療后無(wú)病生存期長(zhǎng)且治愈率高，但PTC的一些組織學(xué)亞型具有胞膜侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，導(dǎo)致病人死亡。早期診斷和及時(shí)正確的治療是提高生存率的關(guān)鍵。深入認(rèn)識(shí)甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，將有可能為治療提供新的線索和途徑。

RECK基因就是新發(fā)現(xiàn)的一種MMP抑制劑。研究表明，其能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制至少3種MMP；即 MMP－2，MMP－9 及 MT1－MMP，進(jìn)而抑制腫瘤的血管形成及轉(zhuǎn)移。具體表現(xiàn)為膜表面錨定的RECK基因抑制 MMP－9前體的分泌，而錨定的RECK蛋白及可溶性RECK蛋白均可抑制MMP－2，MMP－9及 MT1－MMP的活性［7－10］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：甲狀腺乳頭狀癌中MT1－MMP的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織的表達(dá)水平。結(jié)果提示 MT1－MMP參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生，并通過(guò)降解ECM促進(jìn)了甲狀腺乳頭狀癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。并且在腫瘤血管形成過(guò)程中，MT1－MMP均發(fā)揮著重要作用。對(duì) MT1－MMP的檢測(cè)可作為研究甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的臨床生物學(xué)指標(biāo)之一。

Kazal基序逆向誘導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白（reversion－inducing－cysteine－rich protein with kazal motifs，RECK）基因是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，對(duì)多種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo－proteinase，MMPs）的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)起著重要作用［11－13］。RECK蛋白為膜錨定蛋白，而TIMP為可溶性蛋白。因此，RECK蛋白可能只在細(xì)胞表面周圍起作用，而TIMP則在較長(zhǎng)距離外起作用。由于TIMP能與其他類型的膜結(jié)合蛋白（如 MT1－MMP）和ECM形成復(fù)合物，因此，它們也能參與局部調(diào)節(jié)。研究已證實(shí)，在一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，細(xì)胞外水解酶的活性有時(shí)是升高的，如MMP家族水解酶。另有研究也表明，活化的癌基因可抑制ECM成分的表達(dá)，如膠原蛋白等。RECK基因在正常組織中高表達(dá)，而在各種腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染了ras癌基因等的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，許多癌基因如ras，fos，myc等均可下調(diào)RECK基因的表達(dá)，這說(shuō)明RECK基因可能是癌基因共同作用的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)靶位點(diǎn)［14－16］。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：RECK基因在癌旁組織中呈高表達(dá)，而在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈低表達(dá)。結(jié)果提示：RECK可抑制至少3個(gè) MMP家族成員的活性，包 括：MMP－2，MMP－9 及 MT1－MMP，此 外，RECK基因還與血管生成密切相關(guān)，其適量表達(dá)能抑制血管的生成。RECK在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈低表達(dá)說(shuō)明RECK通過(guò)抑制 MT1－MMP的活性，從而影響了proMMP－2的活化。RECK對(duì) MMP－9的抑制作用發(fā)生在翻譯后水平，即抑制 MMP－9從細(xì)胞的釋放以及直接抑制其蛋白水解活性最終抑制了MMP－9的總量及活性從而發(fā)揮抗腫瘤作用。RECK具有獨(dú)特的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)與活性的功能，與許多癌基因信號(hào)及細(xì)胞外基質(zhì)重建密切相關(guān)。

對(duì)于RECK和MT1－MMP之間的相互關(guān)系在甲狀腺乳頭狀癌中的研究少有文獻(xiàn)報(bào)道。RECK主要通過(guò)直接抑制 MMP－2、MMP－9 和 MT1－MMP來(lái)發(fā)揮作用，或通過(guò)抑制 MT1－MMP從而抑制proMMP－2和proMMP－9的活化。但 RECK究竟通過(guò)何種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì) MT1－MMP功能的抑制尚不明了。RECK可與MT1－MMP形成一個(gè)復(fù)合物并抑制其活性；RECK還可在葡萄糖梯度離心過(guò)程中增加同抗去垢膜（detergent－resistant membranes，DRM）結(jié)合的 MT1－MMP的量。另外，對(duì)膜膽固醇的干擾可以明顯的影響RECK對(duì) MT1－MMP的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了通過(guò)抑制酶活性，RECK對(duì)MT1－MMP的調(diào)節(jié)還可通過(guò)直接在細(xì)胞膜上影響其生物學(xué)行為。當(dāng)RECK表達(dá)缺失時(shí)，MT1－MMP的內(nèi)化可以通過(guò)籠狀蛋白或胞膜穴樣內(nèi)陷途徑得已完成；RECK表達(dá)時(shí)，MT1－MMP的內(nèi)化則經(jīng)過(guò)了與之不同的途徑，這表明RECK調(diào)節(jié)了MT1－MMP的內(nèi)化途徑。而途徑的改變又加速了 MT1－MMP的內(nèi)化和降解。本實(shí)驗(yàn)中，甲狀腺乳頭狀癌組織中 MT1－MMP及RECK的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示 MT1－MMP及RECK在甲狀腺乳頭狀癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并且具有協(xié)同作用。聯(lián)合檢測(cè)RECK及 MT1－MMP在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)，為臨床上預(yù)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)合理的綜合治療等提供了重要的理論依據(jù)。

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