劉 涓

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科 武漢430060）

皮膚血管瘤是嬰幼兒最常見的良性血管腫瘤， 是由血管形成異常而引起的疾病，血管瘤的自然病程經(jīng)歷增生期、退化期和退化完成期三個階段。血管瘤屬良性腫瘤，通過未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞彌散增殖而快速生長，之后自發(fā)消退。一般認(rèn)為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因［l，2］。雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退，但是一些血管瘤病變可嚴(yán)重?fù)p壞正常組織，并產(chǎn)生并發(fā)癥。往往給患者及其家人帶來極大痛苦，但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機(jī)制，目前還未明了，因此對于皮膚血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（reversion－inducing－cystein－rich protein with kazalmotifs，RECK）基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄抑制基因，可以通過抑制多種MMPs的表達(dá)，抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallo proteinases，MMPs）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，有研究表明，MMP2的表達(dá)水平同腫瘤的侵襲和惡性程度密切相關(guān)，TIMP－2作為 MMP－2的抑制劑，通過多種方式抑制 MMP－2的活性［4］。但RECK及MMP－2在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)尚未見報道。

本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測了血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中RECK及 MMP－2的表達(dá)水平，探討 RECK 及MMP－2在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為臨床上治療血管瘤提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1材料來源

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2008年－2011年皮膚毛細(xì)血管瘤存檔蠟塊40例，其中男性15例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)S－P法檢測增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤22例，退化期血管瘤18例。另取距癌組織5cm外的周圍正常皮膚組織5例作對照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人RECK及MMP－2單克隆抗體（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2.方法

2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測RECK及MMP－2和PCNA相關(guān)抗原

具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為RECK及MMP－2的陽性對照組，人正常皮膚表皮作為PCNA的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

（1）RECK及 MMP－2都是以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對RECK及MMP－2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗，檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.PCNA的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)強(qiáng)（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)弱（圖2）。

2.RECK的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，RECK呈低表達(dá)（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，RECK呈高表達(dá)（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，RECK呈高表達(dá)（圖5）。圖像分析結(jié)果見表1。增生期組RECK的表達(dá)明顯低于退化期組和正常皮膚組織組（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 血管瘤不同時期RECK表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of RECK positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（）

表1 血管瘤不同時期RECK表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of RECK positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（）

＊ 增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△ 退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲ 正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

陽性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 22 0.0814±0.0088＊ 0.0901±0.0102組別Group例數(shù)n平均光密度Average Optical Density＊退化期組Involuting Group 18 0.2219±0.0116△ 0.2357±0.0117△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.2107±0.0113▲ 0.2231±0.0113▲

3.MMP－2的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)強(qiáng)（圖6）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少的棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱（圖7）；正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱（圖8）。圖像分析結(jié)果見表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞MMP－2的表達(dá)顯著高于退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和正常組織（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同時期MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of MMP－2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（）

表2 血管瘤不同時期MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of MMP－2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P ＜0.05；△ 退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲ 正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

陽性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 22 0.3128±0.0128＊ 0.3367±0.0133組別Group例數(shù)n平均光密度Average Optical Density＊退化期組Involuting Group 18 0.0969±0.0097△ 0.0983±0.0101△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.0929±0.0087▲ 0.933±0.0090▲

3.血管瘤組織中RECK和MMP－2表達(dá)的相關(guān)性

血管瘤組織中RECK與MMP－2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01，r＝－0.625）。

討 論

皮膚血管瘤是一種常見的良性腫瘤，在嬰幼兒中發(fā)病率較高，新生兒的患病率為1.1%－3.8%，至1歲時可高達(dá)10%。血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三個階段。目前血管瘤的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚［5－7］，血管瘤可發(fā)生于身體各處，尤以頭頸部多見，但也見于內(nèi)臟。一些血管瘤可致嚴(yán)重毀容并破壞正常組織，甚至危及生命［8］。目前關(guān)于治療血管瘤方法的成效并不十分顯著，一些治療模式的副作用也限制了其應(yīng)用。因此探討皮膚血管瘤的發(fā)病機(jī)制對臨床上治療血管瘤有著重要的意義。

金屬基質(zhì)蛋白酶（martixmeatllporoteinases，MMPs）是一組具有酶活性的蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，它在維持細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluarma－trix，ECM）包括膠原纖維（纖維狀的非纖維狀的）、纖維連接蛋白、層粘連素、基膜以及基質(zhì)糖蛋白的代謝中起到了關(guān)鍵的作用，一種 MMPs通?？梢灾苯咏到饽骋环N或幾種ECM，也可通過激活其它類型的MMPs而發(fā)揮作用。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的降解是腫瘤侵襲和及轉(zhuǎn)移的必要條件，MMPs幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分［9－12］。因此，MMPs是一組非常重要的蛋白質(zhì)。MMP－2屬Ⅳ型膠原酶類，主要降解明膠、纖維蛋白、基底膜Ⅳ、Ⅴ和Ⅳ型膠原，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障和浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

本實驗研究結(jié)果顯示：增生期血管瘤組織中MMP－2的表達(dá)水平明顯高于退化期和正常組織的表達(dá)水平。結(jié)果提示 MMP－2參與了血管瘤的發(fā)生。并且在腫瘤血管形成過程中，MMP－2均發(fā)揮著重要作用。

RECK（伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘 導(dǎo) 蛋 白 reversion－inducing－cystein－rich protein with kazalmotifs）基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄抑制基因，可以通過抑制多種 MMPs的表達(dá)，從而抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。RECK基因是編碼971個氨基酸的膜表面蛋白，定位于人染色體9p12－13，整個基因的長度約87kb，其中包含21個外顯子，20個內(nèi)含子，共有13個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），其中4個位于基因編碼區(qū)域（外顯子1，9，13，15），而另外9個位于內(nèi)含子區(qū)域（內(nèi)含子5，8，10，12，15，17），其轉(zhuǎn)錄子大小為4.6kb［l3－15］。研究表明，在無 RECK 基因表達(dá)的情況下，MMP的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularMatrix，ECM）過度降解，血管及周圍組織完整性降低，促進(jìn)新生血管形成；相反，RECK基因的高表達(dá)可抑制新生血管的形成。因此，RECK基因及MMP的相互調(diào)節(jié)對于腫瘤新生血管形成起著重要作用，在體內(nèi)多種正常組織的細(xì)胞中均有比較高水平的表達(dá)［l6－18］。因此 RECK 能夠抑制 MMP－2誘導(dǎo)的血管生成作用。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是以腫瘤細(xì)胞與其周圍細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間相互作用的嚴(yán)重紊亂為變化特征的。

本研究發(fā)現(xiàn)，RECK基因主要在增生期血管瘤低表達(dá)，提示RECK可抑制至少3個MMP家族成員的活性，包括：MMP－2，MMP－9 及 MT1－MMP，此外，RECK基因還與血管生成密切相關(guān)，其適量表達(dá)能抑制血管的生成。RECK在血管瘤組織中呈低表達(dá)說明RECK通過抑制MMP－2的活性，從而影響了ProMMP－2的活化。RECK 對 MMP－2的抑制作用發(fā)生在翻譯后水平，即抑制MMP－2從細(xì)胞的釋放以及直接抑制其蛋白水解活性最終抑制了MMP－2的總量及活性從而發(fā)揮抗腫瘤作用。RECK基因的低表達(dá)參與了血管瘤的發(fā)生、發(fā)展。

RECK是MMPs的一種新型抑制劑，關(guān)于RECK與MMP－2相關(guān)性，本研究進(jìn)行了直線相關(guān)分析（P＜0.01，r＝－0.625），結(jié)果證實兩者具有直線負(fù)相關(guān)關(guān)系，也就是MMP－2隨著RECK的表達(dá)增多而表達(dá)減少，證實了RECK具有抑制MMP－2的作用，說明在血管瘤的發(fā)生機(jī)制中確實存在著RECK與MMP－2的調(diào)節(jié)機(jī)制。

RECK基因在腫瘤血管生成方面的抑制作用直接關(guān)系到患者的預(yù)后，RECK與MMP－2呈明顯的負(fù)相關(guān)，在RECK基因表達(dá)降低的病例中 MMP－2呈現(xiàn)出顯著的升高，而MMP－2具有明顯的促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，從而為腫瘤的發(fā)展提供了依據(jù)，同時也證實了RECK基因和MMP－2具有相關(guān)性，RECK基因能夠通過影響MMP－2信號傳導(dǎo)通路而達(dá)到抑制血管瘤血管生成的作用。

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圖 版 說 明

圖1 增生期血管瘤PCNA的表達(dá) 增生的內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)強(qiáng)，S－P×400

圖2 退化期血管瘤PCNA的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），PCNA表達(dá)弱，S－P×400

圖3 增生期血管瘤RECK的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），RECK表達(dá)弱（→），S－P×400

圖4 退化期血管瘤RECK的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，RECK表達(dá)強(qiáng)，S－P×400

圖5 正常對照組RECK的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），RECK表達(dá)強(qiáng)，S－P×400

圖6 增生期血管瘤MMP－2的表達(dá) 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），MMP－2表達(dá)強(qiáng)，S－P×400

圖7 退化期血管瘤MMP－2的表達(dá) 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱或無表達(dá)（→），S－P×400

圖8 正常組MMP－2的表達(dá) 血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱或無表達(dá)（→），SP×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1PCNA expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in the nucleus of proliferating endothelial cells，which showed PCNA expressed strongly（→）.S－P×400

Fig.2PCNA expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in the nucleus of less endothelial cells，which showed PCNA expressed weakly（→）.S－P×400

Fig.3RECK expression in proliferating hemangioma.There were few of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，RECK expressed weakly（→）.S－P×400

Fig.4RECK expression in involuting hemangioma.There were plenty brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，RECK expressed strongly（→）.S－P×400

Fig.5RECK expression in normal skin Group.There were plenty brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，RECK expressed strongly（→）.S－P×400

Fig.6MMP－2expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，MMP－2expressed strongly（→）.SP×400

Fig.7MMP－2expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，MMP－2expressed weakly（→）.S－P×400

Fig.8MMP－2expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，MMP－2expressed weakly（→）.S－P×400