李志雄 范春梅＊ 王 梅 徐 昕

（1.福建省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 福州 350013；2.國家衛(wèi)計委非人靈長類生育調(diào)節(jié)技術(shù)評價重點實驗室 福州 350013）

生殖醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，要求對實驗獼猴排卵情況做出準(zhǔn)確監(jiān)測，現(xiàn)有的獼猴排卵監(jiān)測手段在精確性和可操作性方面存在局限性，難以滿足最新科研的需要。動物排卵測定儀對排卵的監(jiān)測具有簡便易行、準(zhǔn)確、快速等可操作性優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用在家畜和野生動物的排卵監(jiān)測，但在獼猴上尚未見報道。本研究目的在于探索獼猴陰道分泌物電阻值在月經(jīng)周期中變化規(guī)律，并通過與血清E2比較，評價陰道分泌液電阻值作為預(yù)測獼猴排卵指標(biāo)的價值，為建立獼猴的監(jiān)測排卵方法提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗雌猴的選擇 選擇月經(jīng)周期正常、健康狀況良好、有正常生育史、年齡在6～10歲、性皮膚變化明顯的雌猴33只。

1.1.2 實驗動物的飼養(yǎng)管理 對實驗所選的實驗猴單籠飼養(yǎng)。在配種繁殖期間適當(dāng)增加蛋白質(zhì)及維生素E的飼料供應(yīng)。實驗獼猴由福建省人口和計劃生育科研所提供，實驗猴生產(chǎn)許可證（SCXK（閩）2010-0002）,使用許可證分別為(SYXK（閩）2010-0005）。

1.2 儀器設(shè)備 DRANINSKI狗排卵測定儀；貝克曼ACCESS全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；OLYMPUS高級生物顯微鏡。

1.3 試劑 貝克曼公司試劑批號：雌二醇935172；質(zhì)控品：美國伯樂（批號：45232）。

2 方法

2.1 獼猴生殖道電阻值的測定

2.1.1 電阻值測定儀的準(zhǔn)備與消毒 在空氣中檢測確保電池的電量。準(zhǔn)備消毒劑，按消毒步驟的指示給探針消毒。清洗擦干實驗猴陰道周圍皮膚。

2.1.2 測定方法 固定獼猴，從陰道徐徐插入探針5～6 cm處，數(shù)秒后讀取數(shù)據(jù)，探針旋轉(zhuǎn)3周后再讀數(shù)據(jù)，共讀取3次，取其平均值；拔出探針后消毒。

2.1.3 測定時間 在繁殖季節(jié)里，月經(jīng)周期的第2 d開始，每天檢測實驗猴生殖道電阻值，直至下次月經(jīng)周期的到來或止于月經(jīng)周期的第28 d。

2.2 雌二醇激素分泌水平的測定

2.2.1 Access測定原理 雌二醇的檢測是一種使用了延時加入酶結(jié)合物的競爭結(jié)合的酶免疫檢測。樣品和包被了羊抗兔抗體：兔抗雌二醇捕捉抗體的磁性顆粒，以及含蛋白的Tris緩沖液一起被加入到反應(yīng)管中，20 min以后，加入雌二醇-堿性磷酸酶酶結(jié)合物。樣品中的雌二醇與雌二醇-堿性磷酸酶酶結(jié)合物競爭結(jié)合有限的特異性雌二醇抗體的結(jié)合位點，最后抗原-抗體復(fù)合物通過捕捉抗體結(jié)合到磁性顆粒表面。而后，反應(yīng)管被傳送到磁性分離區(qū)域進(jìn)行多次沖洗，去除未和固相結(jié)合的其他成分。最后在反應(yīng)管中加入化學(xué)發(fā)光底物（Lumi-Phos*530），該反應(yīng)所產(chǎn)生的光子并被光電比色計所檢測。光子的產(chǎn)量與樣品中的雌二醇的濃度呈反比，最后，對照儀器中儲存的多點定標(biāo)曲線中所描繪的光量子與標(biāo)準(zhǔn)品雌二醇的對應(yīng)關(guān)系而計算出樣品中的雌二醇濃度。2.2.2 測定時間 在實驗猴月經(jīng)周期第8～12 d，每天上午9：00～10：00進(jìn)行上肢隱靜脈抽血、分離出血清，-80℃保存，全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測E2。

3 結(jié) 果

3.1 獼猴不同月經(jīng)周期生殖道電阻值檢測結(jié)果33只實驗用猴檢測結(jié)果，見圖1-圖2。

圖1 利用排卵測定儀檢測猴生殖道電阻值檢測結(jié)果

圖2 按月經(jīng)周期中所測電阻值最低值的時間為0 d，其前后時間里的檢測結(jié)果

3.2 血清雌二醇的檢測結(jié)果 33只實驗用猴在月經(jīng)周期的第8～12 d測定血清雌二醇的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 血清E2檢測結(jié)果

3.3 電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差實驗猴例數(shù)所占總例數(shù)的百分率 33個月經(jīng)周期中，實驗猴陰道電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差的實驗猴例數(shù)百分率，見表1、圖4。

表1 實驗猴陰道電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差的例數(shù)百分率

4 結(jié)果分析

1）根據(jù)對實驗獼猴陰道電阻值的檢測，結(jié)果顯示月經(jīng)周期第11 d出現(xiàn)最低值。在猴卵泡期初始，月經(jīng)周期的第4 d陰道電阻值由587±184Ω逐步下降至排卵期第11 d的213±179Ω，最低值在100Ω左右；隨著黃體期的到來，電阻值又急速上升，到第16 d上升至 365±148Ω，第 22 d平穩(wěn)在 390±140Ω水平。排卵期電阻值與卵泡期及黃體期的電阻值差異非常顯著。以電阻值最低點均值76±33Ω與其前后1 d的電阻值均值194±32Ω和208±29Ω差異也非常明顯（P＜0.01）。

圖4 例數(shù)百分率餅狀圖

2）本實驗血清E2高峰日出現(xiàn)在月經(jīng)周期第10 d，濃度為187.8±123.3 pg/mL與張惠云等[1]報道相似（卵泡期 E2濃度為 245±193 pg/mL），E2的分泌高峰日與李沛等[2]通過針刺對雌性獼猴生殖內(nèi)分泌影響的研究，發(fā)現(xiàn)雌性獼猴E2峰值出現(xiàn)在月經(jīng)周期的第9±1 d相符合。陰道電阻值最低日與E2峰日吻合率為36.4%，提前1 d的例數(shù)占總數(shù)的18.2%，提前2 d的例數(shù)有21.2%，以上三者相加占總數(shù)的75.8%，說明生殖道分泌物電阻值最低日主要出現(xiàn)在E2峰日或在其后2 d內(nèi)。劉宏偉[3]在排卵監(jiān)測各指標(biāo)的意義中認(rèn)為血液中的E2主要來自優(yōu)勢卵泡，在卵泡發(fā)育進(jìn)入活躍期后上升，并成倍遞增，排卵前24～36 h 達(dá)峰值（雌激素第一峰＞732 pmo1/L），提示卵泡發(fā)育成熟；排卵后快速下降，約為峰值的50%。據(jù)報道，在排卵前雌激素峰值期，宮頸黏液的鋸齒形變化現(xiàn)象最為顯著，此系黏液素的存在形成的氯化鈉晶體，排卵臨近時，宮頸黏液中不僅氯化鈉含量增加，而且體積增加10～12倍[4]。由于排卵前宮頸黏液稀薄，分泌量明顯增加，易流入陰道內(nèi)，與陰道內(nèi)少量分泌液混合，排卵前氯化鈉濃度增加，所測定的陰道電阻值必然減小。因獼猴陰道口小，陰道皺折多，位于胼胝底之間，難以應(yīng)用擴張器械探查、采集宮頸黏液，因此，難以用宮頸黏液的評分方法來預(yù)測獼猴排卵。

3）使用排卵測定儀來監(jiān)測動物（狐、羊、牛等）發(fā)情與排卵已得以證實。李滌非等[5]在北極狐發(fā)情陰道分泌物電阻值變化規(guī)律的觀察中認(rèn)為，“黏液電測法”完全可以用來進(jìn)行雌狐的發(fā)情鑒定，當(dāng)雌狐陰道分泌物電阻值達(dá)到最高峰，并開始急劇下降的第1～2 d放對，可很快達(dá)成交配。秦新等[6]用電阻測定母羊最適授精時間提高受孕率實驗觀察，用電阻測定法確定發(fā)情母羊最適配種，可使發(fā)情母羊凍配受孕率提高43%。根據(jù)吳元昌等[7]在發(fā)情鑒定儀測定母牛適宜配種時機實驗結(jié)果證實，母牛發(fā)情前期電阻值最高，隨著發(fā)情旺盛的出現(xiàn)電阻值逐漸下降，發(fā)情后期電阻值開始回升。

4）通過對獼猴的實驗研究，揭示了月經(jīng)周期內(nèi)生殖道電阻值隨著E2分泌水平的變化而呈現(xiàn)出有規(guī)律性變化。該法簡便易行、無創(chuàng)傷、無副作用，適于在獼猴繁殖和相關(guān)科研中使用。可用B型超聲儀監(jiān)測獼猴卵泡發(fā)育及排卵動態(tài)情況，進(jìn)一步研究與探索陰道電阻值與排卵的關(guān)系。

[1]張惠云,喬明,陳雨振,等.正常獼猴性周期相關(guān)指標(biāo)的檢測[J].中藥藥理與臨床,2002,189(1):46-47.

[2]李沛,王訓(xùn)立.針刺對雌性恒河猴生殖內(nèi)分泌抑制性影響的研究[J].中國針炙,1999,19(8):486-488.

[3]劉宏偉.排卵監(jiān)測各指標(biāo)的意義 [J].實用婦產(chǎn)科雜志,2008,24(8):457-460.

[4]Monghissi K S.Prediction and detection[J].Fertil Steril,1980,34:89.

[5]李滌非,耿孝媛,吳曉民,等.北極狐發(fā)情期陰道分泌物電阻值變化規(guī)律的觀察[J].經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報,2003,7(2):11-14.

[6]秦新,南朝俊,牛海昌,等.用電阻測定母羊最適授精時間提高受孕率[J].黑龍江動物繁殖,2004,12(1):29.

[7]吳元昌,鄭羽,高建新.發(fā)情鑒定儀測定母牛適宜配種時機[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(2):92-93.