沈陽市化工學(xué)校

前 言

冬蟲夏草與鹿茸、人參齊名為我國的傳統(tǒng)三大補(bǔ)品，是滋補(bǔ)強(qiáng)身的名貴中藥。隨著對(duì)蟲草認(rèn)識(shí)的深入，國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蟲草的需求日益擴(kuò)大。但是，由于野生冬蟲夏草采收的不易，且對(duì)生長環(huán)境要求的嚴(yán)格性使得其資源稀少，價(jià)格昂貴。另外，因?yàn)樾枨蟮牟粩嘣鲩L，造成濫采濫挖，現(xiàn)在我國的野生蟲草資源大量減少，目前已被列為國家一級(jí)保護(hù)物種。

在冬蟲夏草供不應(yīng)求的情況下，蛹蟲草日益受到人們的關(guān)注，為醫(yī)藥和保健開發(fā)了新的藥源和營養(yǎng)源。

蛹蟲草具有多種藥理作用:能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，抗炎、抗菌、抗癌、抗缺氧等;蛹蟲草能鎮(zhèn)靜催眠，提高機(jī)體免疫力，降血脂，防止動(dòng)脈硬化，保護(hù)心、腦組織等。

目前國外對(duì)于蛹蟲草的研究比較少，主要研究比較多的集中在國內(nèi)。大多數(shù)廠家采用的是無菌接種、固體發(fā)酵開放式培養(yǎng)基、深加工提取活性物質(zhì)等技術(shù)，產(chǎn)品的主要類型為蟲草子實(shí)體以及相應(yīng)的生化提取多種成分的深加工產(chǎn)品兩種。但是鮮有對(duì)蟲草菌液以及液體菌種發(fā)酵的研究，在中職中藥專業(yè)及中草藥中職專業(yè)中開展實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目研究更是少之又少，本項(xiàng)目主要集中在蛹蟲草的人工育種菌液的研究、形成一套適合中職學(xué)校相關(guān)專業(yè)實(shí)訓(xùn)教學(xué)的實(shí)訓(xùn)方案。

1 材料與儀器

1.1 菌種

蛹夏草菌株

1.2 主要材料

大米粉、豆餅粉、麥芽粉、MgS04?7H2O、pH 試紙及調(diào)節(jié)試劑。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（PDA）

1.4 主要儀器及設(shè)備

超凈工作臺(tái)、空調(diào)、菌種培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、酸度計(jì)、奧林巴斯三目顯微鏡、解剖鏡、PDA 培養(yǎng)基。

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 組織分離育種

選無雜菌的罐頭瓶中長4～6cm 狀態(tài)好的蟲草：將子實(shí)體洗去土和雜物，用75%酒精消毒，用滅菌水沖洗后。在超凈工作臺(tái)上用手術(shù)刀將選用的子實(shí)體切成上下兩截，選取蟲草子實(shí)體，用接種針小心地截取子實(shí)體的中間偏向頂端部位或中間處，挑取所截取的子實(shí)體上面的一小塊內(nèi)部組織，接種到PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)從而獲得候選菌株，經(jīng)過栽培試驗(yàn)，鑒別菌種的性能。

2.2.液體深層發(fā)酵培養(yǎng)

通過液體深層培養(yǎng)法獲得的蟲草菌絲體，菌絲體的化學(xué)成分接近從自然界中采集的蛹蟲草的化學(xué)成分，可從發(fā)酵液中得到所需物質(zhì)，還能很大程度上縮短生產(chǎn)的周期。

2.3 出草試驗(yàn)

于罐頭瓶中裝入大米，一定量的自來水，瓶口用雙層聚丙烯膜進(jìn)行包扎。將罐頭瓶放在121℃滅菌1h。冷卻后，在無菌條件下進(jìn)行注射接入液體菌。培養(yǎng)約7d，至培養(yǎng)基中長滿菌絲后上架。接種約50d，蟲草子實(shí)體頂部子囊殼開始膨大后采收。

2.4 菌種的保存

保藏菌株，測(cè)定菌絲干重和子實(shí)體產(chǎn)量。

3 結(jié)果

3.1 組織分離育種部位的選擇

選取蟲草有龜狀紋的部位，沿縱向切開一個(gè)小口，縱向撕開成兩塊，用接種針截取子實(shí)體中間偏向頂端部位或中間處，挑取所截取的子實(shí)體上面的一小塊內(nèi)部組織，接種到PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)從而獲得候選菌株，經(jīng)過栽培試驗(yàn)，菌種的性能優(yōu)異。

表1 不同組織部位對(duì)蛹蟲草生長的影響

3.2 出草試驗(yàn)溫度的控制

500 ml 罐頭瓶，裝大米25g，無菌處理過的注射器注入自來水40ml，自來水中含不同組分營養(yǎng)，瓶口采用雙層聚丙烯膜進(jìn)行包扎。121℃滅菌1h。完全冷卻后，無菌條件下注射接入6ml 液體菌種，每個(gè)處理20 個(gè)重復(fù)。14℃～17℃、17℃～20℃、20℃～23℃、23℃～26℃溫度段條件下通風(fēng)培養(yǎng)7d。期間照射（300lx 散射光），子實(shí)體突起出現(xiàn)后，光照強(qiáng)度加強(qiáng)，400lx 光間歇照射，1h 照射，80min 間歇，同時(shí)將罐頭瓶封口膜刺破，以增加通風(fēng)。20℃～23℃通風(fēng)條件下，暗條件培養(yǎng)，培養(yǎng)基中長滿菌絲后上架。接種約50d，蟲草子實(shí)體頂部子囊殼開始膨大后采收子實(shí)體產(chǎn)量最佳。

表2 不同溫度對(duì)蛹蟲草生長的影響

3.3 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基

蟲草在進(jìn)行菌絲發(fā)酵時(shí)碳源以蛋白胨為最優(yōu)，采用1：2 或1：3 的碳氮比較為合適；蛹蟲草菌絲發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成為5%大米粉、1．5%豆餅粉、1．5%麥芽粉、0．1%KH2P04，0．05%MgS04?7H2O。

表3 不同碳氮比對(duì)冬蟲夏草生長的影響

3.4 菌種的保存條件

10℃/5℃（晝夜）、黑暗、散射光、白熾燈持續(xù)照射三種實(shí)驗(yàn)條件，保藏30d，散射光菌株表現(xiàn)為菌落邊緣整齊，菌絲致密，菌絲長速均勻穩(wěn)定，菌絲干重和子實(shí)體產(chǎn)量較高。

表4 不同光照對(duì)蛹蟲草生長的影響