張靜，趙欣

（1.重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶400030；2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

蟲(chóng)茶是一種主產(chǎn)于我國(guó)的不屬于普通茶葉的范疇，但卻以保健茶或藥用茶的形式出現(xiàn)的以昆蟲(chóng)食葉后排泄的蟲(chóng)糞粒泡制的奇特茶飲料[1]。生產(chǎn)蟲(chóng)茶的昆蟲(chóng)已知有夜蛾科弓須亥夜蛾Hydrillodes morosa Butler.（化香夜蛾、黃紋淡黑夜蛾）與雪疽夜蛾Nodaria niphona Butler.；螟蛾科米縞螟Aglossa dimidiata Haworth.（米黑蟲(chóng)），黃條谷螟Herculia glaucinalis L.（谷粗喙螟），白條谷螟Fujimacia bicoloralis Leech.，均是以幼蟲(chóng)取食苦藤茶、苦丁茶、化香樹(shù)、大百解、三葉海棠等植物的葉片后，排泄的蟲(chóng)糞，收集加工即成為蟲(chóng)茶產(chǎn)品[2]。其中貴州產(chǎn)蟲(chóng)茶除了遍銷(xiāo)全國(guó)還遠(yuǎn)銷(xiāo)東南亞，貴州產(chǎn)蟲(chóng)茶主要是米縞螟弓須亥夜蛾等昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)啃食樟科潤(rùn)楠屬的川黔潤(rùn)楠（Machilus chuanchienensis S.Lee.）腐熟幼嫩葉片后經(jīng)由昆蟲(chóng)體內(nèi)特殊代謝排出糞粒曬干制成[3]。

蟲(chóng)茶作為傳統(tǒng)飲品和中藥，具有清熱、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，對(duì)腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是一種很好的醫(yī)藥保健飲料[4]。蟲(chóng)茶中含有 K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Zn 等共 17 種礦物質(zhì)元素，其中約有10種元素為人體必需微量元素，且Fe、Zn、Ca、Mg等元素含量較高，優(yōu)于一些名優(yōu)茶[5]。此外，不同蟲(chóng)茶中還富含有粗蛋白、粗纖維、脂肪、茶多酚、咖啡堿、糖分、維生素和氨基酸[6-7]。近年關(guān)于茶葉在抗癌方面的研究已經(jīng)全免展開(kāi)，其中類(lèi)茶類(lèi)茶飲料的抗癌研究也獲得了初步結(jié)果。關(guān)于蟲(chóng)茶的抗癌效果還沒(méi)有開(kāi)展，為了驗(yàn)證蟲(chóng)茶的體外抗乳腺癌效果，本研究初步對(duì)貴州出產(chǎn)蟲(chóng)茶進(jìn)行了MCF-7人乳腺癌細(xì)胞體外抗癌功能性的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

蟲(chóng)茶：市售原產(chǎn)貴州蟲(chóng)茶，進(jìn)行冷凍干燥后用沸水3次提取后蒸干后得到水提物，將提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后待用。

1.2 癌細(xì)胞株

MCF-7人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 human breast adenocarcinoma cells）購(gòu)自ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，美國(guó)）。

1.3 試劑

DMSO為日本純正化學(xué)株式會(huì)社產(chǎn)品，D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP （sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、Fetal b ovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100unit/mL Penicillin-Streptomycin均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。Trizol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，western抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.4 儀器與設(shè)備

R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；VS-15CFN冷凍離心機(jī)：韓國(guó)Vision科學(xué)株式會(huì)社；MC096二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；HB-402V超凈工作臺(tái)、HB-205SW恒溫水浴震蕩器：韓國(guó)Hanbeak科學(xué)株式會(huì)社；PM-1OAK倒置顯微鏡、BXS0熒光顯微鏡：日本奧林巴斯株式會(huì)社；Elx800酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio Tekinstruments公司。

1.5 方法

1.5.1 MTT法癌細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)

將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞接種于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換2～3次培養(yǎng)基，6 d～7 d傳代一次。將培養(yǎng)的癌細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 180 μL。5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后按每孔20 μL加入樣品?？變?nèi)試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)劑量組，分別為50、100、200 μg/mL。48 h 培養(yǎng)后，每孔加入 20 μL MTT 試劑（質(zhì)量濃度為5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束培養(yǎng)后吸棄孔內(nèi)上清液后，按每孔150 μL加入DMSO后震蕩30 min，540 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=[（空白孔OD值-樣品孔OD 值）/空白孔 OD 值]×100%[8]。

1.5.2 DAPI熒光染色的癌細(xì)胞凋亡觀察

經(jīng)樣品處理后的癌細(xì)胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常溫下固定細(xì)胞10 min，然后用熒光染料 4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）溶液染色10 min。用PBS溶液漂洗染色后的細(xì)胞2次，熒光顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照[9]。

1.5.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析

同等條件下用RNAzol試劑制備MCF-7人乳腺癌細(xì)胞總RNA。定量分離到RNA后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR 法擴(kuò)增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以1%瓊脂電泳（含濃度溴化乙錠）檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.5.4 Western blot分析

用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，分離上清，用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg～50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，電印跡至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。將印跡的NC膜依次進(jìn)行封閉、與第一抗體、第二抗體結(jié)合，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲(chóng)茶的體外抗癌作用試驗(yàn)效果

采用MTT法，檢測(cè)蟲(chóng)茶的體外抗癌效果。結(jié)果顯示，蟲(chóng)茶水提取物對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨樣品質(zhì)量濃度增加而增加。以200 μg/mL濃度處理MCF-7人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制率（78%）。以100、50 μg/mL濃度處理M CF-7人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為43%和11%（表2）。由此可見(jiàn)，蟲(chóng)茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有增殖抑制效果，濃度較高時(shí)抑制效果更顯著。

表2 MTT法測(cè)定蟲(chóng)茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果Table 2 Inhibition of the growth of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells by sandy tea as evaluated by MTT assay

2.2 蟲(chóng)茶誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡細(xì)胞核能發(fā)出藍(lán)色熒光，通過(guò)觀察細(xì)胞著色情況我們即可判定細(xì)胞是否凋亡。對(duì)照組MCF-7人乳腺癌細(xì)胞染色后細(xì)胞核邊緣清晰，著色均勻。經(jīng)蟲(chóng)茶水提取物不同濃度（200、100、50 μg/mL）處理后的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核濃染、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而其中以200 μg/mL濃度作用下表現(xiàn)的更為明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)蟲(chóng)茶處理后MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Appearance of apoptotic body in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells treated with sandy tea

可見(jiàn)蟲(chóng)茶對(duì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡具有很強(qiáng)的作用，且以200 μg/mL濃度的作用效果明顯。

2.3 蟲(chóng)茶葉對(duì)Bax，Bcl-2和caspases基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)影響

蟲(chóng)茶水提取物以不同濃度處理MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，以200 μg/mL濃度處理過(guò)的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞Bax，caspase-3和caspase-9表達(dá)最強(qiáng)，以100和50 μg/mL質(zhì)量濃度處理過(guò)的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中Bax，caspase-3和caspase-9表達(dá)呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)；Bal-2的mRNA表達(dá)中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度樣品處理后，隨著濃度的升高表達(dá)減弱。由此可以看出，在200μg/mL質(zhì)量濃度處理下蟲(chóng)茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于其他濃度（圖2）。

圖2 經(jīng)蟲(chóng)茶處理后MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的Bax，Bcl-2和caspases的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.2 Effects of sandy tea on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells

3 討論

蟲(chóng)茶作為一種保健茶葉飲品，其部分功能性已經(jīng)得到證實(shí)。乳腺癌是女性排名第一的常見(jiàn)惡性腫瘤，除了醫(yī)學(xué)的治療手段外，通過(guò)堅(jiān)持食用保健食品可以預(yù)防和幫助治療乳腺癌已經(jīng)得到證實(shí)[12]。對(duì)癌細(xì)胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預(yù)防效果。本文中隨著蟲(chóng)茶樣品濃度的增加MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的增值減少，證明蟲(chóng)茶可以明顯的在體外抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡是在生理或病理?xiàng)l件下，由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)程序化死亡過(guò)程。在癌癥發(fā)生過(guò)程中凋亡相關(guān)基因的突變或表達(dá)異?？梢宰钄喟┘?xì)胞的凋亡，促使癌癥發(fā)生[13]。Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對(duì)量高于Bcl-2時(shí)，Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[14]。本研究中隨著處理癌細(xì)胞的蟲(chóng)茶濃度的增加，癌細(xì)胞的Bax表達(dá)加強(qiáng)，Bcl表達(dá)減弱，可以認(rèn)為蟲(chóng)茶可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而起到對(duì)乳腺癌的預(yù)防作用。Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡，caspase-9為凋亡途徑的上游caspase，caspase-3為下游caspase，caspase-9作為啟動(dòng)性caspase，隨著表達(dá)的加強(qiáng)可以加強(qiáng)對(duì)下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡[15]。由此可以看出蟲(chóng)茶對(duì)癌細(xì)胞的caspase-3和9的作用可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本文以貴州蟲(chóng)茶為基準(zhǔn)進(jìn)行了體外抗癌效能比較實(shí)驗(yàn)，得出蟲(chóng)茶具有很強(qiáng)的體外抗癌效果的結(jié)果。蟲(chóng)茶對(duì)動(dòng)物的抗癌效果和對(duì)人體的臨床作用也有待更深層次的研究。

[1] 勵(lì)建榮,周李婷.中國(guó)蟲(chóng)茶現(xiàn)狀及其研究開(kāi)發(fā)思路[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2005,34(3)：4-7

[2] 蔣三俊.中國(guó)蟲(chóng)茶資源及其保健功用[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2000,3(5)：36

[3] 楊立昌,乙引,秦樊鑫,等.貴州省不同產(chǎn)地蟲(chóng)茶重金屬元素含量的測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,39(4)：392-393

[4] 李時(shí)珍.本草綱目：下冊(cè)[M].哈爾濱：北方文藝出版社,2007：2215

[5]楊立昌,乙引.蟲(chóng)茶資源開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技學(xué),2011,32(8)：470-472

[6] 許乾麗,茅向軍,周雪松.老鷹茶和蟲(chóng)茶的6種生命元素分布狀態(tài)和存在形態(tài)研究[J].貴州科學(xué),1999,17(2)：140-143

[7] 郭時(shí)印,許伍霞,文禮章,等.三葉蟲(chóng)茶營(yíng)養(yǎng)成分的分析與評(píng)價(jià)[J].昆蟲(chóng)知識(shí),2008,45(1)：128-132

[8]SKEHAN P,STORENG R,MONKS SA,et al．New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J]．Journal of the National Cancer Institute,1990,82(13)：1107-1112

[9] 趙欣.黃茶的HT-29人體結(jié)腸癌細(xì)胞的體外抗癌效果[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2009,23(3)：11-13

[10]ZHAO X,KIM SH,QI YC,et al．Effects of different kinds of salt in comutagenicity and growth of cancer cells[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition,2012,41(1)：26-32

[11]KIM YA,RHEE SH,PARK KY,et al．Antiproliferative effect of resveratrol in human prostate carcinoma cells[J].Journal of Medicinal Food,2003,6(4)：273-280

[12]齊秀英,張安玉,武光林,等.飲食與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的探討[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),1990,12(3)：221-227

[13]徐立紅.細(xì)胞凋亡相關(guān)的組合生物標(biāo)志物的分子基礎(chǔ)及其在環(huán)境毒理學(xué)中的意義[J].水生生物學(xué)報(bào),2005,29(3)：329-335

[14]DELIC R,S姚TEFANOVIC M．Optimal laboratory panel for predicting preeclampsia[J].Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine,2010,23(1)：96-102

[15]BLANC C,DEVERAUX QL,KRAJEWSKI S,et al．Caspase-3 is essential for procaspase-9 processing and cisplatin-induced apoptosis of MCF-7 breast cancer cells[J].Cancer Research,2000,60(16)：4386-4390