徐瑩，梁紅敏

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院乳品工程學(xué)院，內(nèi)蒙古，包頭014035）

0 引言

細(xì)菌素是由一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，其抑菌范圍不僅僅局限于親緣關(guān)系較近的種，而且，產(chǎn)生細(xì)菌素菌株對(duì)該細(xì)菌素具有自身免疫性[1-2]，能夠抑制腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)。如今，國(guó)內(nèi)外已分離鑒定到多種產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株，有些乳酸菌素作為食品防腐劑被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)[3]。細(xì)菌素的產(chǎn)生一般與菌株的生長(zhǎng)情況有關(guān)[4-6]。同時(shí),細(xì)菌素的產(chǎn)量還受菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分等多種因素影響。

植物乳桿菌T102是從中國(guó)自然發(fā)酵香腸中分離篩選到具有較強(qiáng)產(chǎn)細(xì)菌素能力的乳酸菌菌株，對(duì)影響植物乳桿菌T102菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)細(xì)菌素的因素進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該菌株細(xì)菌素具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

菌株為植物乳桿菌T102（實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵香腸中分離鑒定所得）；指示菌為金黃色葡萄球菌（來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存）。

培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基[7]。

設(shè)備：SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，HS-840u超凈工作臺(tái)，Acculab電子分析天平，722s紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

采用改良的瓊脂擴(kuò)散法[8]測(cè)定抑菌活性，以金黃色葡萄球菌為指示菌。發(fā)酵液以8 000 g離心20 min得到發(fā)酵上清液，調(diào)節(jié)pH值為7.0，上清液中加入質(zhì)量濃度為600 g/L硫酸銨飽和溶液在4℃下震蕩過(guò)夜，已脫鹽的溶液過(guò)0.22 μm濾膜得到細(xì)菌素溶液。粗提的細(xì)菌素連續(xù)稀釋備用。制備質(zhì)量濃度為8 g/L瓊脂的LB培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至50℃，接入金黃色葡萄球菌（106mL-1），混勻后傾倒平板，取50 μL上述細(xì)菌素溶液于平板上，在37℃下培養(yǎng)48 h。細(xì)菌素效價(jià)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定[9]。

1.2.2 植物乳桿菌T102生長(zhǎng)量及活菌數(shù)

測(cè)定方法：用722s分光光度計(jì)在600 nm處，測(cè)接種的MRS液體培養(yǎng)基的吸光值（OD值），活菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

（1）培養(yǎng)溫度的影響。培養(yǎng)基pH值不變，分別在20，25，30，37，45 ℃5個(gè)溫度下培養(yǎng)24 h，測(cè)OD值及細(xì)菌素效價(jià)。

（2）培養(yǎng)基初始pH值的影響。用濃度為6 mol/L的HCl或NaOH調(diào)pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，121℃滅菌15 min，30℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)OD值及細(xì)菌素效價(jià)。

1.2.4 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別替換其中的碳源、氮源，添加不同濃度的KH2PO4、NaCl和吐溫-80，在培養(yǎng)基初始pH值為6.0，30℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD值、細(xì)菌素效價(jià)及植物乳桿菌T102的活菌數(shù)。以MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基為正常對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.1.1 溫度的影響

培養(yǎng)基pH值不變，分別在不同溫度下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD值及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由圖1可以看出，培養(yǎng)基pH值一定的條件下，不同溫度培養(yǎng)時(shí)，植物乳桿菌T102菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)細(xì)菌素的能力有很大的不同。在37℃時(shí)，菌株達(dá)到最大生物量時(shí)，所產(chǎn)細(xì)菌素的生物活性卻沒(méi)有在30℃時(shí)的高。這說(shuō)明菌株最適生長(zhǎng)溫度并不是細(xì)菌素活性最大時(shí)的溫度，這與一些資料報(bào)道的某些細(xì)菌素在低于最適生長(zhǎng)溫度下反而細(xì)菌素產(chǎn)量較高相符合，說(shuō)明細(xì)菌素的產(chǎn)生或許是一種應(yīng)激機(jī)制，對(duì)不適應(yīng)于其最佳生長(zhǎng)環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。菌株T102在30℃培養(yǎng)24 h細(xì)菌素效價(jià)最高可達(dá)590 IU/mL，在20℃時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)菌素的產(chǎn)生，而且菌株在該溫度下生長(zhǎng)速度緩慢。

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH值的影響

將MRS培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，8.0和9.0，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生有明顯的影響。初始pH值為6.0時(shí)，培養(yǎng)24 h后菌株產(chǎn)細(xì)菌素達(dá)到最高產(chǎn)量，為589 IU/mL,初始pH值為7.0，在培養(yǎng)24 h后，菌株的生物量達(dá)到最高，但細(xì)菌素效價(jià)低于初始pH值為6.0的效價(jià)，初始pH值為5.0和8.0的菌株生長(zhǎng)緩慢，且只有少量的細(xì)菌素檢出，初始pH值為4.0和9.0的無(wú)抑菌活性檢出。這說(shuō)明菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)與細(xì)菌素的產(chǎn)生并不是完全成比例，細(xì)菌素在一定的pH值條件下才會(huì)合成，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生，這可能與細(xì)菌素的合成機(jī)制有關(guān)。

圖2 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.2 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.2.1 碳源的影響

在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的不同碳源，30℃培養(yǎng)24 h后,分別測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如表1所示。

表1 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由表1可以看出，不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和細(xì)菌素的產(chǎn)生具有較大的影響。添加果糖、乳糖、麥芽糖的培養(yǎng)基，植物乳桿菌T-102的活菌數(shù)、生長(zhǎng)量和效價(jià)值都比正常對(duì)照值高，其中，乳糖是最易利用的碳源，菌株生長(zhǎng)和合成細(xì)菌素的能力都最強(qiáng)，該菌株對(duì)蔗糖和淀粉的能力較弱，菌株雖然也可以利用蔗糖和淀粉但是生長(zhǎng)和合成細(xì)菌素能力較低。

在以乳糖為培養(yǎng)基碳源的基礎(chǔ)上,又研究了乳糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及細(xì)菌素素合成的影響.在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳糖,培養(yǎng)24 h后,測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素活性.結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，2.5%的乳糖對(duì)菌體生長(zhǎng)和細(xì)菌素的合成效果最好。

表2 乳糖濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.2.2 氮源的影響

在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的不同氮源,30℃培養(yǎng)24 h后,分別測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如表3所示。

表3 氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由表3可以看出，與其他氮源相比，牛肉膏和酵母提取物的菌體生長(zhǎng)量與合成細(xì)菌素的能力都比正常值要高，酵母提取物是最易利用的氮源，活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量和成和細(xì)菌素的能力都最高，菌株雖然也能利用酪蛋白，但是菌株的活菌數(shù)和合成細(xì)菌素的能力都明顯較低。氮源的種類影響細(xì)菌素的產(chǎn)量，這可能與細(xì)菌素合成機(jī)制有關(guān)，可能某些氮源中豐富的成分誘導(dǎo)了細(xì)菌素基因的啟動(dòng)[12]。

在以酵母提取物為培養(yǎng)基氮源的基礎(chǔ)上,研究酵母提取物濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及細(xì)菌素素合成的影響.在培養(yǎng)基中加入不同濃度的酵母提取物,培養(yǎng)24 h后,測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素活性.結(jié)果如表4所示,可以看出，2.0%酵母提取物對(duì)菌體生長(zhǎng)和細(xì)菌素的合成能力最好。

表4 酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

2.2.3 KH2PO4的影響

在培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的KH2PO4,30℃培養(yǎng)24 h后，分別測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如表5所示。

表5 KH2PO4濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由表5可以看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同，菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)細(xì)菌素能力有所不同，除了2.5%生長(zhǎng)量低于正常對(duì)照組外，其他濃度的KH2PO4，活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量和效價(jià)都比正常對(duì)照值要高，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的KH2PO4最有利于菌體生長(zhǎng)和合成細(xì)菌素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的KH2PO4合成細(xì)菌素的能力下降。

2.2.4 NaCl的影響

在培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，3.0%，5.0%的NaCl,30℃培養(yǎng)24h后,分別測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如表6所示。

表6 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由表6可以看出，添加NaCl對(duì)菌株生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成能力都有影響。0.5%和1.0%的活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量和效價(jià)都比正常對(duì)照值要高，其中1.0%NaCl最有利于菌體生長(zhǎng)和合成細(xì)菌素。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的NaCl雖然菌株能夠正常生長(zhǎng)，但合成細(xì)菌素的能力下降，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的NaCl活菌數(shù)和菌體生長(zhǎng)量和效價(jià)較正常值低，不利于菌株的生長(zhǎng)，產(chǎn)細(xì)菌素的能力明顯下降，因此，較高的NaCl濃度阻礙菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)細(xì)菌素。

2.2.5 吐溫-80的影響

在培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L的吐溫-80,30℃培養(yǎng)18 h后,分別測(cè)定活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量及細(xì)菌素效價(jià)。結(jié)果如表7所示。

表7 吐溫-80對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響

由表7可以看出，不添加吐溫-80，菌體可以正常生長(zhǎng)，但是卻沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)菌素。與其他濃度吐溫-80的相比，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的吐溫-80合成細(xì)菌素的能力都最高，菌體生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異，說(shuō)明吐溫-80對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，但是對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生卻有重大的影響。吐溫-80的濃度越大，菌體生長(zhǎng)量與合成細(xì)菌素的能力反而降低。吐溫-80是一種乳化劑，它可以降低菌體與培養(yǎng)基接觸面之間的表面張力，從而改善乳酸菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞及代謝產(chǎn)物排出體外，因而促進(jìn)細(xì)菌素的產(chǎn)生從而使細(xì)菌素的活力增強(qiáng)[13]。

3 結(jié)論

在培養(yǎng)基pH值不變的條件下，30℃時(shí)的細(xì)菌素活性較高，而37℃時(shí)菌體的生長(zhǎng)量最大，在20℃時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)菌素的產(chǎn)生，而且菌株在該溫度下生長(zhǎng)速度緩慢。在培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)菌體生長(zhǎng)量較低，但是細(xì)菌素活性要高于pH值為7.0的培養(yǎng)基,初始pH值為4.0和9.0的無(wú)抑菌活性檢出。乳糖合成細(xì)菌素的能力最強(qiáng)，菌株雖然也可以利用蔗糖和淀粉但是合成細(xì)菌素能力較低。酵母提取物是最易利用的氮源，活菌數(shù)、菌體生長(zhǎng)量最大的同時(shí)合成細(xì)菌素的能力也最高。分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%乳糖、2.0%酵母提取物、2.0%的KH2PO4和1.0%的NaCl最有利于菌體生長(zhǎng)和合成細(xì)菌素。吐溫-80沒(méi)有顯著促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的作用，但是對(duì)細(xì)菌素的合成具有很大的影響，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的吐溫-80合成細(xì)菌素的能力最高。本研究有助于深入了解培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)植物乳桿菌T102生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響，但是還需進(jìn)一步進(jìn)行植物乳桿菌T102發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的條件優(yōu)化，使植物乳桿菌T102細(xì)菌素能夠得到廣泛應(yīng)用。

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