陳雪姣，姜啟興，許艷順，劉富俊，肖成立，許兆濱，夏文水，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122;2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧大連116113)

南極磷蝦(Euphausia superba)，又名大磷蝦或南極大磷蝦。南極磷蝦的生物量為6.5～10億噸［1］，資源蘊(yùn)藏量巨大，是可供人類利用的海洋動(dòng)物資源中蘊(yùn)藏量最為豐富的一種，也是人類重要的后備蛋白庫［2］，除富含蛋白外，還含有人體所必需的全部氨基酸，富含亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質(zhì)元素，且類胡蘿卜素色素含量高［3-4］。目前，國內(nèi)研究更多關(guān)注南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應(yīng)用［5］，國外則側(cè)重于對(duì)酶、脂肪酸等的分離純化及其性質(zhì)分析［6-7］，對(duì)磷蝦殼資源的研究較少。蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發(fā)利用，例如甲殼素。

目前利用蝦殼廢棄物制備甲殼素的技術(shù)存在明顯不足:如一般采用強(qiáng)酸(HCl)脫鈣和強(qiáng)堿(NaOH)脫蛋白，不僅這兩種化學(xué)品對(duì)甲殼素的分子鏈都有一定的破壞，能耗高，廢棄物對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重，而且其中的蛋白、鈣質(zhì)等礦物質(zhì)均作為雜質(zhì)被除去，無法回收［8］。國外已有利用微生物發(fā)酵，對(duì)蝦蟹等廢棄物進(jìn)行生物發(fā)酵制備甲殼素的研究，Zakaria［9］使用副干酪乳桿菌發(fā)酵蝦殼，蛋白質(zhì)去除率為77.5%。Jung［10］使用了副干酪乳桿菌發(fā)酵蟹殼，5d后使用另外一株靈桿菌繼續(xù)發(fā)酵，最終脫蛋白率達(dá)到52%。該技術(shù)與傳統(tǒng)的酸堿法相較反應(yīng)更溫和、甲殼素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，成本低、是一種節(jié)能環(huán)保的清潔生產(chǎn)方法，發(fā)酵殘?jiān)礊榇旨讱に?，?jīng)簡(jiǎn)單處理即可得到食用級(jí)甲殼素，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)資源全面有效的利用，并且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［11］。

基于上述背景，本研究以篩選出的高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌B-1水解磷蝦加工下腳料中的蛋白質(zhì)，研究發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌B-1產(chǎn)蛋白酶活力的變化，同時(shí)優(yōu)化發(fā)酵脫蛋白條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦(Euphausia superb) 遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供，于-18℃凍藏，冷凍南極磷蝦自然解凍，經(jīng)采肉機(jī)采肉三次后得南極磷蝦殼，于-18℃凍藏備用;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 江南大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，活化后備用。

JB 5374-91電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)有限公司;YCR-180采肉機(jī) 上海華夏漁業(yè)機(jī)械儀器工貿(mào)公司;501型超級(jí)恒溫器 上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠;90-2恒溫磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;UV1000紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;4K-15高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;THZ-D恒溫振蕩器 太倉市豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外加碳源對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蝦殼蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量 6%(1 ×108cfu/mL)，37℃下120r/min搖床發(fā)酵36h，以不添加碳源為對(duì)照，分別添加葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉作為碳源，添加量均為10%;測(cè)定發(fā)酵液蛋白酶活力及蝦殼蛋白去除率，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量6%，37℃下?lián)u床發(fā)酵，轉(zhuǎn)速 120r/min，每隔12h取樣測(cè)定，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.3 料液比對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL容量的玻璃瓶中，料液比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 接種量 6%，37℃下轉(zhuǎn)速120r/min搖床發(fā)酵36h，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.4 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL玻璃瓶中，接種量分別 1%、2%、4%、6%、8%，料液比 1∶3，37℃ 下120r/min搖床發(fā)酵36h，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.5 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比 1∶3，接種量 4%，分別于 30、35、37、40 和 45℃下?lián)u床發(fā)酵36h，轉(zhuǎn)速120r/min，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.6 轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，料液比1∶3，接種量4%，37℃下?lián)u床發(fā)酵36h，轉(zhuǎn)速分別為0、60、120、180、240、300r/min，每個(gè)樣品平行3 次。

1.2.7 起始pH對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 分別準(zhǔn)確稱取25g南極磷蝦殼經(jīng)121℃高溫滅菌處理，裝于250mL的玻璃瓶中，起始 pH 分別為6.5、7.5、8.5、9.5 和 10.5，料液比 1∶3，接種量4%，120r/min搖床發(fā)酵36h，每個(gè)樣品平行3次。

1.2.8 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上選擇因素水平，外加碳源、轉(zhuǎn)速、起始pH對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活力和蝦殼蛋白去除率的影響不大，而料液比過大對(duì)發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)回收不利，料液比過小影響溶氧量和酶活，故選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量三因素，以蛋白去除率為指標(biāo)，采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 發(fā)酵脫蛋白正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test of deproteinization by fermentation

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白酶活力的測(cè)定 紫外分光光度法(QB/T1803-1993蛋白酶)。以L-酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)275為縱坐標(biāo)，得到L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物的工作曲線回歸方程為:y=0.0075x-0.0058，相關(guān)系數(shù) R2=0.999。

1.3.2 蛋白質(zhì)去除率的測(cè)定 蛋白質(zhì)去除率的測(cè)定參照 Aytekin［12］，按照以下公式計(jì)算:

蛋白質(zhì)去除率(%)=(原料中總蛋白質(zhì)量-濾渣中蛋白質(zhì)量)/原料中總蛋白質(zhì)量×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件;數(shù)據(jù)繪圖采用 Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶及蛋白去除率的影響

2.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 不同的碳源對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響和蛋白去除率結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，與不添加碳源的對(duì)照組相比較，添加葡萄糖等碳源的發(fā)酵組，其蛋白酶活力略有增加，但在幾種糖之間無顯著差異。而添加水溶性淀粉組對(duì)酶活影響反而無益，對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)無影響，產(chǎn)酶也沒有較大的提高，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因有可能是由于南極磷蝦加工下腳料本身即可作為碳源氮源，且富含 Zn、Fe、Cu、Mn 等微量元素，Na、K、Ca、P、Mg 等常量元素［13］，均可作為枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)因子，綜上考慮及成本的控制，下面的實(shí)驗(yàn)均不另外加入碳源。

圖1 碳源的選擇對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.1 Effect of different carbon source on proteolytic activity and DP rate by Bacillus subtilis B-1

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響測(cè)定了不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶的活力以及蛋白去除率，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

從圖2可以看出，在12～36h內(nèi)，蛋白酶活力呈上升趨勢(shì)，在36h蛋白酶活力最高，達(dá)到1550U/mL，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于發(fā)酵初始，南極磷蝦加工下腳料提供氮源，枯草芽孢桿菌在12～36h之間由對(duì)數(shù)期達(dá)到穩(wěn)定期，在這期間產(chǎn)酶活性趨于增加，但是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由36～72h時(shí)，菌種由穩(wěn)定期向衰亡期過渡，蛋白酶活力也隨之下降，但是由于蛋白酶的持續(xù)水解作用，蝦殼的蛋白去除率則隨著發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸升高。

2.1.3 料液比對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同料液比下枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶活力及蛋白去除率，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

由圖3表明，在發(fā)酵過程中，不同的料液比，發(fā)酵液的產(chǎn)酶活力也不同，最適宜料液比為1∶3，此時(shí)的蛋白酶活力及蛋白去除率都達(dá)到最高?？赡芰弦罕炔煌瑢?duì)溶氧量有一定的影響，枯草芽孢桿菌是需氧菌，低溶氧不利于產(chǎn)酶［14］。

2.1.4 接種量對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.4 Effect of different inoculum quanity on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

由圖4表明，接種的枯草芽孢桿菌越多，發(fā)酵液的產(chǎn)酶活力和蝦殼的蛋白去除率呈現(xiàn)總體增加的趨勢(shì)，到4%以后趨于平穩(wěn);產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是當(dāng)接種量增大到一定量時(shí)，菌種因?yàn)樯L(zhǎng)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的累積及營養(yǎng)的消耗，抑制了菌體的產(chǎn)酶速率。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響研究了不同的發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

圖5表明，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液的產(chǎn)酶活力先升高后降低，最優(yōu)發(fā)酵溫度為37℃，此時(shí)產(chǎn)酶活力為1560U/mL，溫度過低不利于菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)酶，溫度過高，菌體易衰老而影響其正常生長(zhǎng)和代謝。

2.1.6 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，轉(zhuǎn)速為120r/min時(shí)蛋白酶活力最大，轉(zhuǎn)速由0～120r/min之間，隨著轉(zhuǎn)速的增大，蛋白酶活力增大，說明轉(zhuǎn)速增大，溶氧增大，有利于產(chǎn)酶;當(dāng)轉(zhuǎn)速大于120r/min時(shí)蛋白酶活力不再升高，可能是轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，對(duì)枯草芽孢桿菌本身有損害，從而使蛋白酶活力降低。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.6 Effect of rotate speed on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

2.1.7 起始pH對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響 研究了不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響，結(jié)果見圖7。由圖7表明，最優(yōu)pH為8.5，接近于蝦殼自身的pH，此時(shí)蛋白酶活力為1590U/mL，pH降低或者升高，蛋白酶活力均降低，說明弱酸及弱堿環(huán)境均不利于菌株產(chǎn)酶。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中為了考慮人力成本及實(shí)驗(yàn)效果，發(fā)酵起始pH則使用蝦殼自身的pH即可。

圖7 起始pH對(duì)產(chǎn)酶活力和蛋白去除率的影響Fig.7 Effect of different initial pH on protease production and DP rate by Bacillus subtilis B-1

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不外加碳源，轉(zhuǎn)速選擇120r/min，起始pH選擇蝦殼自身pH，考慮到枯草芽孢桿菌是需氧菌及發(fā)酵液的溶氧量，料液比選擇1∶3，對(duì)發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度和接種量三因素的正交實(shí)驗(yàn)水平選擇在48～72h，35～40℃和2%～6%的范圍內(nèi)。

2.2 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

以蛋白去除率為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度和接種量進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2中極差分析可以看出，影響枯草芽孢桿菌B-1發(fā)酵蝦殼的蛋白脫除率因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，即發(fā)酵周期為主要因素，其次是接種量、發(fā)酵溫度;最佳發(fā)酵條件為A3B2C2，即發(fā)酵時(shí)間72h，發(fā)酵溫度37℃，接種量為4%。為驗(yàn)證該優(yōu)化的效果，進(jìn)行了兩次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果蛋白去除率分別為:87.5%、90.3%，平均值為88.9%，高于正交最高值85.30%，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，此時(shí)在最優(yōu)參數(shù)下，發(fā)酵液中的酶活力為1670U/mL。

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果分析Table 2 Orthogonal test arrangement and the result analysis

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)(料液比1∶3、轉(zhuǎn)速120r/min、蝦殼自身pH)的基礎(chǔ)上，通過發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)探明了影響發(fā)酵南極磷蝦脫蛋白效果的另外三種主要因素影響順序?yàn)?發(fā)酵周期對(duì)蛋白去除率影響最大，發(fā)酵溫度次之，接種量影響最小。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間72h，發(fā)酵溫度37℃，接種量為4%，料液比1∶3。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，蛋白去除率可達(dá)88.9%左右，可以作為南極磷蝦生物發(fā)酵制備甲殼素的參考條件。到目前為止，所有發(fā)酵相關(guān)的研究都旨在評(píng)價(jià)生物處理的脫礦物質(zhì)和脫蛋白效果，在此研究之前，Jo等［15］篩選 Serratia marcescens FS-3 發(fā)酵蟹殼，發(fā)酵7d后蛋白質(zhì)去除率為84%，不同的微生物自身產(chǎn)蛋白酶的能力不一樣，本研究中枯草芽孢桿菌高效的蛋白去除率和更短的發(fā)酵周期使得微生物發(fā)酵提取甲殼素這種節(jié)能環(huán)保的生產(chǎn)技術(shù)有了更大的進(jìn)步。未來需要進(jìn)一步解決的是規(guī)模擴(kuò)大的技術(shù)問題，真正實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵提取甲殼素的工業(yè)生產(chǎn)。

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