牛 伶，李 坦，汪 毅，劉媛媛，鮑揚(yáng)漪

(安徽省合肥市第一人民醫(yī)院血液科，安徽合肥 230061)

對(duì)于急性白血病及高危組骨髓增生異常綜合癥患者，單純性化療及自體干細(xì)胞移植可提高生存率，但復(fù)發(fā)率相對(duì)較高［1－2］;異基因造血干細(xì)胞移植減少了復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率及移植相關(guān)死亡率高且費(fèi)用昂貴［3］。目前郭梅等［4］報(bào)道顯示活化HLA錯(cuò)配的外周血造血干細(xì)胞(HLA-mismatched peripheral blood stem cells;Mismatched-BPSC)輸注聯(lián)合化療治療老年白血病與單純化療的對(duì)照組相比顯著提高了緩解率與生存率，部分有微崁合，均無(wú)GVHD。國(guó)外也有數(shù)個(gè)小樣本的臨床研究嘗試對(duì)非移植的難治性、復(fù)發(fā)性惡性血液病患者給予供者白細(xì)胞輸注治療，其方案多樣，有供者動(dòng)員與非動(dòng)員、輸注前給予患者小劑量全身照射預(yù)處理與非照射的、HLA相合與錯(cuò)配的等等，取得了一定的療效，其療效與植入與否不一致［5－7］。

我科于2012年始對(duì)10例惡性血液病患者給予G-CSF動(dòng)員的HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療，現(xiàn)將其安全性報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集 2012年1月至2013年9月10例在我院接受Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療治療的惡性血液病患者，所有患者均為初治或復(fù)發(fā)難治惡性血液系統(tǒng)疾病，無(wú)HLA相合的供者或因各種原因拒絕行經(jīng)典造血干細(xì)胞移植、PS≤2分;同時(shí)未接受過(guò)自體或異體干細(xì)胞移植、全身照射及氟達(dá)拉濱、阿侖單抗等藥物治療;女3例，男7例，年齡28～81歲，中位年齡49歲。按2008年WHO分類、2009NCCN急性髓系白血病(AML)危險(xiǎn)度及骨髓增生異常綜合征(MDS)國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)分組(表1)。所有參與臨床試驗(yàn)患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

表1 入組患者基礎(chǔ)情況及化療方案

1.2 主要試劑 重組人G-CSF為麒麟鯤鵬(中國(guó))生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，GT-T552無(wú)血清培養(yǎng)基為日本Takara生物公司生產(chǎn)，細(xì)胞因子檢測(cè)ELISA試劑盒、LDH殺傷檢測(cè)試劑盒為碧云天生物公司產(chǎn)品，免疫細(xì)胞表型鑒定熒光標(biāo)記抗體均為美國(guó)BD Bioseience公司產(chǎn)品。

1.3 HLA高分辨配型、嵌合監(jiān)測(cè) 化療前入選患者及供者均經(jīng)實(shí)驗(yàn)室行HLA配型。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-測(cè)序分型(polymerase chain reaction sequencebased typing，PCR-SBT)對(duì) HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1 進(jìn)行高分辨分型:首先進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增，以產(chǎn)物作為模板行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化及變性后電泳，結(jié)果由ASSIGN軟件(CONEXIO)進(jìn)行HLA等位基因的分析確認(rèn)。HLA-Mismatched-BPSC回輸后第7天、第14天采用STR-PCR和毛細(xì)管電泳片段分析方法對(duì)供、受者進(jìn)行16個(gè)STR位點(diǎn)基因型檢測(cè)并計(jì)算嵌合率。

1.4 外周干細(xì)胞動(dòng)員、采集、相關(guān)檢測(cè)及回輸HLA-Mismatched-BPSC采自患者健康的直系親屬，采集前供者接受重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)10 μg·kg－1·d－1×5 d，使用費(fèi)森尤斯卡比血細(xì)胞分離機(jī)進(jìn)行外周血干細(xì)胞采集，共采集兩次。并對(duì)外周血干細(xì)胞行單核和細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、CD3+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。除首次回輸?shù)母杉?xì)胞外，將采集的剩余細(xì)胞置于－196℃液氮中凍存。

1.5 治療方案 所有患者均未接受免疫抑制處理，HLA-Mismatched-BPSC均在化療結(jié)束24～48 h內(nèi)輸注;首次化療結(jié)束后即第一次回輸?shù)腍LA-Mismatched-BPSC為新鮮的外周造血干細(xì)胞，此后每次配伍化療回輸則為首次采集后凍存的外周血干細(xì)胞。患者于回輸前口服塞來(lái)昔布與地塞米松，本試驗(yàn)中患者接受3次HLA-Mismatched-BPSC回輸(圖1)。如患者接受化療后粒細(xì)胞低于0.5×109·L－1，則予以重組人粒細(xì)胞刺激因子 300 μg·d－1，直至患者粒細(xì)胞恢復(fù)至正常值。

圖1 治療路線及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)路線圖

1.6 血象恢復(fù)時(shí)間及不良反應(yīng)觀察 根據(jù)張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)患者進(jìn)行評(píng)價(jià);血象恢復(fù)時(shí)間:中性粒細(xì)胞 ＞0.5 ×109·L－1連續(xù)3 d、血小板＞30×109·L－1連續(xù)3 d。不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)按照美國(guó)國(guó)立癌癥研究所/NCI《常見(jiàn)不良事件評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》(Common terminology criteria for adverse events，CTCAE version 4.0)進(jìn)行安全評(píng)估，分為 I～V級(jí)5個(gè)級(jí)別，Ⅲ～V級(jí)不良反應(yīng)視為嚴(yán)重不良反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 HLA配型、嵌合度監(jiān)測(cè) 10對(duì)供受者均為HLA單倍相合:其中6對(duì)供受者在HLA-A/-B/-DR6個(gè)位點(diǎn)中有3個(gè)位點(diǎn)相合，4對(duì)有4個(gè)位點(diǎn)相合。例6患者在回輸后第7、10天檢測(cè)出20%嵌合，第14天嵌合檢測(cè)為0%;其余9例未檢測(cè)出嵌合。

2.2 HLA-Mismatched-BPSC的采集和回輸 經(jīng)治患者進(jìn)行化療的同時(shí)接受HLA-Mismatched-BPSC回輸3次，平均每次回輸給患者CD34+細(xì)胞為(0.9～10.2)×106·kg－1;單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量為(1.6 ～8.9)×108·kg－1;CD3+細(xì)胞數(shù)量為(0.22 ～2.4)×108·kg－1(表2)。

表2 平均回輸?shù)膯魏撕图?xì)胞、CD34+細(xì)胞、CD3+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)

2.3 不良反應(yīng) 10例患者在化療聯(lián)合干細(xì)胞輸注治療后24 h內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，最高可達(dá)39.4℃，予以抗感染及激素治療后24 h內(nèi)體溫恢復(fù)正常，維持3 d以上。所有經(jīng)治患者均未見(jiàn)肝損、出血、腹瀉、水腫等GVHD發(fā)生。其中5例患者接受細(xì)胞輸注時(shí) CD3+T 細(xì)胞≥1.5 ×108·kg－1，在接收細(xì)胞輸注后24 h內(nèi)胸、腹部及四肢出現(xiàn)皮疹，采用對(duì)癥治療后2 d內(nèi)迅速緩解。

2.4 患者行HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療與自身僅化療時(shí)血象恢復(fù)時(shí)間對(duì)比 本次入組患者有4例可進(jìn)行自身對(duì)比，見(jiàn)表3。

表3 患者血象恢復(fù)時(shí)間對(duì)比

2.5 療效評(píng)價(jià) 5例外周血干細(xì)胞輸注聯(lián)合化療初治患者均完全緩解，隨訪時(shí)間3～22個(gè)月。3例外周血干細(xì)胞輸注聯(lián)合化療鞏固患者均完全緩解，目前隨訪6～34個(gè)月。2例外周血干細(xì)胞輸注聯(lián)合化療復(fù)發(fā)患者，1例髓外復(fù)發(fā)病灶短暫消失，此后失訪，1例未緩解。

3 討論

目前比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為異基因移植患者的免疫抑制及輸注的干細(xì)胞數(shù)量是確保移植物植入及誘發(fā)GVHD重要原因。有報(bào)道對(duì)13例難治性實(shí)體腫瘤及12難治性惡性血液病行100 cGy的全身照射及非動(dòng)員異基因淋巴細(xì)胞輸注治療。其中實(shí)體腫瘤患者6例接受臍血輸注，7例接受同胞淋巴細(xì)胞輸注;血液病患者1例接受臍血輸注，11例接受同胞淋巴細(xì)胞輸注;18例同胞供受者之間，17例為全相合，1例為5/6匹配。實(shí)體腫瘤患者本方法治療前未接受高強(qiáng)度化療，而惡性血液病患者治療前均不同程度接受含免疫抑制劑的高強(qiáng)度化療。實(shí)體腫瘤患者均為檢測(cè)出嵌合。惡性血液病患者9例發(fā)生嵌合。范圍從5%到100%，其中5例發(fā)生GVHD［5］。Colvin等報(bào)道對(duì)15例性實(shí)體腫瘤及26難治性惡性血液病行100 cGy的全身照射及半相合異基因外周干細(xì)胞輸注治療。29患者接受至少1×108·kg－1CD3+細(xì)胞輸注，其中10例檢測(cè)出短暫嵌合，有兩例達(dá)100%嵌合，其中1死于GVHD;另外12接受較低劑量 CD3+細(xì)胞輸注者未檢測(cè)出嵌合［6］。提示嵌合與否決定于免疫抑制的程度及輸注的干細(xì)胞數(shù)量。Strair等報(bào)道了16例自體造血干細(xì)胞移植患者接受異基因淋巴細(xì)胞輸注，有4例發(fā)生GVHD，其在淋巴細(xì)胞輸注前曾接受免疫抑制治療;而其余未接受免疫抑制治療12例患者，無(wú)此現(xiàn)象發(fā)生［8］。本研究中僅1例發(fā)生短暫嵌合，其余9例未觀測(cè)到嵌合發(fā)生，本試驗(yàn)中所有患者在化療配伍干細(xì)胞輸注前均未接受過(guò)免疫抑制治療，故推測(cè)因保留了自身的免疫功能，從而排斥移植物的植入因而未能發(fā)生嵌合;沒(méi)有一例發(fā)生GVHD也可說(shuō)明這一點(diǎn)。其中1例患者輸注的較大劑量的CD34+細(xì)胞，而出現(xiàn)短暫嵌合，提示輸注的干細(xì)胞數(shù)量對(duì)移植物的植入起一定作用。國(guó)內(nèi)有報(bào)道101例大劑量化療聯(lián)合體外處理的干細(xì)胞輸注治療急性白血病，4例發(fā)生短暫嵌合，無(wú)1例發(fā)生GVHD也證明了以上推測(cè)，該報(bào)道對(duì)23例患者進(jìn)行微嵌合檢測(cè)，其中20例陽(yáng)性［9］;而本實(shí)驗(yàn)中是未經(jīng)處理的干細(xì)胞直接輸注，且未行微嵌合檢測(cè)，故是否存在微嵌合有待進(jìn)一步檢測(cè)及研究。另一種可能是由于輸注的細(xì)胞包含有造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、NK細(xì)胞，其能調(diào)節(jié)TH1/TH2細(xì)胞平衡，而防止GVHD發(fā)生。

目前有研究表明對(duì)難治性惡性血液病患者進(jìn)行HLA-Mismatched-BPSC輸注，CD3+細(xì)胞輸注量不少于1×108·kg－1的患者在輸注后出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、腹瀉及水腫等不良反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)到輸注后IL-5、IL-6、IL-8 、IL-10、IFN-γ 等細(xì)胞因子明顯增高;患者出現(xiàn)的相關(guān)癥狀與體征考慮與外周血干細(xì)胞輸注后患者機(jī)體釋放各種細(xì)胞因子引起［6］。本研究中患者無(wú)論輸注的CD3+細(xì)胞量多少，接受治療后均出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象在予以包含激素的治療后短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常，且維持3 d天以上，皮疹在激素治療后迅速緩解，也提示這種類過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生可能為機(jī)體釋放各種細(xì)胞因子引起——即所謂的細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中患者輸注的HLA-Mismatched-BPSC是一群異質(zhì)細(xì)胞，其中患者每次接受的干細(xì)胞中含有較多的CD3+T細(xì)胞，且其中含有一定數(shù)量的NK細(xì)胞，異體T、NK細(xì)胞注入，可能是造成患者輸注后發(fā)熱、皮疹等應(yīng)激反應(yīng)的原因。根據(jù)John L Reagan［10］的試驗(yàn)結(jié)果，這種過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生往往預(yù)示著較好的應(yīng)答率與治療預(yù)期。

郭梅等［9］報(bào)道了101例大劑量化療聯(lián)合體外處理的干細(xì)胞輸注治療急性白血病的文章中，發(fā)生微嵌合的患者其血細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間較單純化療對(duì)照組有所縮短。在本研究中HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療相對(duì)單純化療，患者血細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間有縮短傾向，與上述報(bào)道一致;推測(cè)這是由于輸注的細(xì)胞包含有造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞，其能促進(jìn)患者造血恢復(fù);另一個(gè)可能即輸注的干細(xì)胞與G-CSF共同促進(jìn)了患者造血恢復(fù)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

報(bào)道［6］顯示對(duì)26例難治惡性血液病患者進(jìn)行異基因血細(xì)胞輸注，部分患者可重新獲得緩解，其推測(cè)是由于外周血干細(xì)胞輸注打破了患者對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，激活了患者免疫系統(tǒng)起到抗腫瘤作用，而非移植物抗腫瘤效應(yīng)。本研究中8例為完全緩解，1例髓外復(fù)發(fā)患者病灶有短暫的消失。干細(xì)胞輸注后9例無(wú)嵌合發(fā)生，故可排除移植物抗白血病效應(yīng);由于本研究為HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合了化療，缺乏僅化療患者對(duì)照組、隨訪時(shí)間較短，HLA-Mismatched-BPSC輸注是否具有非特異性抗腫瘤作用和其對(duì)長(zhǎng)期生存時(shí)間的影響有待進(jìn)一步對(duì)比與跟蹤。

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