張立蘋+曹輝+劉西梅+畢延震+肖紅衛(wèi)+李莉+華再東+華文君

摘要：為探索在實驗室條件下最佳的小鼠胚胎冷凍保存條件。對不同發(fā)育階段小鼠胚胎按照同一個冷凍程序進行冷凍;兩個不同的冷凍程序?qū)ν粋€發(fā)育階段的小鼠胚胎進行冷凍。結(jié)果表明，-7 ℃平衡10 min，然后以0.3 ℃/min的速率迅速降至-35℃，-35 ℃平衡5 min后投入液氮中，此冷凍程序比較適合小鼠胚胎冷凍;冷凍保存對16細胞以上的小鼠胚胎影響較小。

關(guān)鍵詞：小鼠;胚胎;冷凍保存

中圖分類號：Q954.4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4915-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.037

Cryopreservation Conditions for Mouse Embryo

ZHANG Li-ping1，CAO Hui2，LIU Xi-mei1，BI Yan-zhen1，XIAO Hong-wei1，LI Li1，HUA Zai-dong1，HUA Wen-jun1

（1.Institute of Animal and Veterinary Science/ Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China; 2.Pulike Biological Engineering Inc.， Luoyang 471000， Henan， China）

Abstract： The optimal cryopreservation conditions of growth stage and cryopreservation process for mouse embryo were investigated. The results showed that the optimal program was putting the embry into -7 ℃ for 10 min， then cooling rate to -35℃ with -0.3 ℃/min， after holding for 5 min， putting it into liquid nitrogen for cryopreservation. It had a small effect on the embryos with more than 16-cell.

Key words： mouse; embryo; cryopreservation

小鼠胚胎冷凍體外受精胚胎移植自1972年Whittingham等[1]首次用液氮冷凍保存小鼠胚胎成功后，哺乳動物胚胎冷凍保存技術(shù)取得了飛躍的進展，在畜牧業(yè)和實驗動物種質(zhì)保存中發(fā)揮了巨大的作用。隨著遺傳工程小鼠的大量出現(xiàn)，建立一種常規(guī)的安全可靠的胚胎冷凍方法保存這些極其珍貴的遺傳資源至關(guān)重要。本試驗對影響小鼠受精胚胎冷凍因素進行了對比，旨在尋找在本實驗室條件下最佳的小鼠胚胎冷凍條件，建立一種適合于本實驗室的無需專業(yè)實驗室人員即可操作的快速簡便的動物胚胎冷凍方法，從而用于指導實踐。

1 ?材料與方法

1.1 ?小鼠胚胎的獲取

6～10周齡昆明白雌鼠控光（14 h光照，10 h黑暗）飼養(yǎng)1～2周后，腹腔注射10 IU/支PMSG（寧波激素制品廠）46～48 h腹腔注射10 IU/支hCG（寧波激素制品廠）進行超排。注射hCG后與雄鼠合籠，次日早晨檢查陰道栓。

見栓雌鼠分別于注射hCG后52～54 h、65～66 h和77 ～78 h處死，采集4-cell、8-cell和16-cell以上細胞。

1.2 ?胚胎冷凍

冷凍液為從乙二醇（Ethylene glycol，EG）冷凍液（直接從北京市譚河科技開發(fā)中心購買，貨號TH044）。先將胚胎移入已經(jīng)預熱過的EG中室溫平衡5 min，再裝入0.25 mL的塑料細管中，每管2～5個胚胎。將裝有胚胎的塑料細管放入冷凍儀（planer，英國）中，按照試驗設(shè)計的程序運行。運行完畢后，迅速投入液氮罐中保存。

1.3 ?胚胎解凍

胚胎冷凍保存1周后解凍。自液氮罐中取出塑料細管，室溫下于空氣中停留數(shù)秒后置入盛有32 ℃水浴的燒杯中，停留數(shù)秒。取出細管，將解凍后的胚胎推入平皿中，再移入已經(jīng)預熱的M16，用M16洗3次以便徹底去除EG。

1.4 ?胚胎培養(yǎng)

培養(yǎng)液為M16（Sigma），提前2 h將M16做50 μL微滴并覆蓋石蠟油，放入CO2培養(yǎng)箱中平衡。將解凍胚胎移入培養(yǎng)微滴中，10～15枚/滴，放入37.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)并記錄發(fā)育率和囊胚發(fā)育率。

1.5 ?胚胎細胞計數(shù)

將胚胎移入含10 μg/mL的Hoechst33342的M2中處理10 min，后在熒光顯微鏡下觀察，記錄胚胎細胞數(shù)。

1.6 ?試驗設(shè)計

1）對不同發(fā)育階段（4-cell、8-cell、16-cell以上）小鼠胚胎按照同一個冷凍程序進行冷凍，解凍后比較3個發(fā)育階段小鼠胚胎的發(fā)育率和囊胚率。

2）采用兩個不同的冷凍程序?qū)ν粋€發(fā)育階段的小鼠胚胎進行冷凍，程序1：-7 ℃平衡10 min，然后以0.3 ℃/min的速率迅速降至-35 ℃，-35 ℃平衡5 min后投入液氮中;程序2：5℃平衡5 min，后以0.2 ℃/min的速率降至-7 ℃，-7 ℃平衡5 min，以0.5 ℃/min速率降至-30 ℃，-30 ℃平衡5 min后投入液氮中。解凍后比較兩個冷凍程序?qū)ν粋€發(fā)育階段小鼠胚胎的影響。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響

從表1可以看出，冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響有明顯差異（P<0.05），其中解凍后胚胎（4-cell、8-cell、16-cell）發(fā)育率分別為10.0%、35.2%、84.2%;囊胚發(fā)育率（4-cell、8-cell、16-cell）分別為0%、45.5%、62.5%。

2.2 ?冷凍程序?qū)π∈笈咛サ挠绊?/p>

從表2可以看出，冷凍程序?qū)π∈笈咛ダ鋬龊笥绊戯@著（p<0.05），程序1、程序2解凍后胚胎發(fā)育率分別為84.2%、60.2%，囊胚率分別為62.5%、36.2%。

3 ?討論

胚胎冷凍是長期保存動物種質(zhì)資源的一項實用技術(shù)。胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展和應用減少了時間和空間對胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活體運輸所造成的疾病傳播。以前，小鼠和人的冷凍胚胎常用PG作為保護劑，但是最近研究證明，EG毒性較小[2-4]，并且已廣泛用于動物胚胎的慢速和玻璃化冷凍[5]。本試驗采用牛胚胎的冷凍程序[6]，同時將其冷凍和解凍程序進行簡化后對小鼠不同發(fā)育階段（4-cell、8-cell及16-cell以上）的胚胎進行了冷凍，解凍后發(fā)現(xiàn)，4-cell和8-cell胚胎有部分胚胎的透明帶已經(jīng)完全破損，雖然有的胚胎透明帶完好，但是細胞質(zhì)出現(xiàn)微小的顆粒，并且細胞間距和卵周隙增大，分析可能因為4-cell和8-cell胚胎放入冷凍液后卵裂球因脫水收縮造成;16-cell以上不出現(xiàn)透明帶破損現(xiàn)象，去除冷凍液后，胚胎也可以恢復到冷凍前狀態(tài)，但是細胞質(zhì)內(nèi)同樣出現(xiàn)微小顆粒，與羅明久等[7]的結(jié)果相同。經(jīng)培養(yǎng)后，16-cell以上的胚胎囊賠率可以達到62.5%，低于孫艷香等[8]報道的凍后發(fā)育率（91%），但是遠遠高于4-cell（0%）和8-cell（45.5%），此結(jié)果與Tao等[9]相同。

1972年Whittingham等[1]建立了緩慢冷凍法，并且第一次報道小鼠胚胎冷凍獲得成功，將胚胎置于冷凍保護劑中，利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱分階段降溫。在胚胎凍存的四個階段中：①從室溫降至誘發(fā)結(jié)晶溫度;②誘發(fā)結(jié)晶（Seeding）;③慢速（0.3 ℃ ～0.5 ℃/min）冷凍至一個中間溫度（-30 ℃ ～-35 ℃）;④快速冷凍至液氮溫度（-196 ℃）。目前，胚胎的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，體外生產(chǎn)（IVP）的胚胎低溫保存已經(jīng)取得成功[10]。隨著冷凍技術(shù)的不斷進步，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，現(xiàn)已建立了許多冷凍保存的方法，常用的有常規(guī)的緩慢冷凍法、玻璃化冷凍法和開放式拉管法等。本試驗對小鼠胚胎進行了程序化冷凍條件的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的冷凍程序?qū)π∈笈咛サ膿p傷不同，慢速冷凍的速率越快，對胚胎的損傷越大，胚胎死亡率越高，透明帶破損率越高，囊胚率越低。

參考文獻：

[1] WHITTINGHAM D G，LEIBO S P，MAZUR P.Survival of mouse embryos frozen to -196℃ and ?-206 ℃[J].Science，1972，178（59）：411-414.

[2] DONNAY I，AUQUIER P， KAIDI S ，et al.Vitrification of in vitro produced bovine blastocysts：methodological studier and developmental capacity[J].Anim Reprod Sci，1998，52：93-104.

[3] SOMMERFELD V，NIEMANN H.Cryopreservation of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezingor vitrification[J].Cryobiology，1999，38：95-105.

[4] ZHU S E，KASAI M，OTOGE H ，et al.Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions[J].J Reprod Fertil，1993，98：139-145.

[5] ALI J，SHELTON JN.Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos[J]. J Reprod Fertil，1993，99：471-477.

[6] EMILIANI S，VAN DEN BERGH M，VANNIN A S， et al.Comparison of ethylene glycol，1，2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes，4-cell embryos and blastocysts[J].Hum Reprod，2000，15：905-910.

[7] 羅明久，劉 ?娜，苗德強，等.應用乙二醇冷凍小鼠胚胎：優(yōu)化和簡化程序的探索[J].生物工程學報，2005，21（5）：766-772.

[8] 孫艷香，姜國誠，雷俊英.小鼠囊胚玻璃化冷凍保存研究[J].廣西師范大學學報，2002，20（3）：73-75.

[9] TAO J，TAMIS R，F(xiàn)INK K.Cryopreservation of mouse embryos at morula/compact stage[J].J Assist Reprod Genet，2001，18：235-243.

[10] FUKUDA Y，ICHIKAWA M，NAITO K，et al.Birth of nomal calves resulting from bovine oocytes matured，fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to blastocyst stage[J].Biol Reprod，1990，42：114-119.

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響

從表1可以看出，冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響有明顯差異（P<0.05），其中解凍后胚胎（4-cell、8-cell、16-cell）發(fā)育率分別為10.0%、35.2%、84.2%;囊胚發(fā)育率（4-cell、8-cell、16-cell）分別為0%、45.5%、62.5%。

2.2 ?冷凍程序?qū)π∈笈咛サ挠绊?/p>

從表2可以看出，冷凍程序?qū)π∈笈咛ダ鋬龊笥绊戯@著（p<0.05），程序1、程序2解凍后胚胎發(fā)育率分別為84.2%、60.2%，囊胚率分別為62.5%、36.2%。

3 ?討論

胚胎冷凍是長期保存動物種質(zhì)資源的一項實用技術(shù)。胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展和應用減少了時間和空間對胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活體運輸所造成的疾病傳播。以前，小鼠和人的冷凍胚胎常用PG作為保護劑，但是最近研究證明，EG毒性較小[2-4]，并且已廣泛用于動物胚胎的慢速和玻璃化冷凍[5]。本試驗采用牛胚胎的冷凍程序[6]，同時將其冷凍和解凍程序進行簡化后對小鼠不同發(fā)育階段（4-cell、8-cell及16-cell以上）的胚胎進行了冷凍，解凍后發(fā)現(xiàn)，4-cell和8-cell胚胎有部分胚胎的透明帶已經(jīng)完全破損，雖然有的胚胎透明帶完好，但是細胞質(zhì)出現(xiàn)微小的顆粒，并且細胞間距和卵周隙增大，分析可能因為4-cell和8-cell胚胎放入冷凍液后卵裂球因脫水收縮造成;16-cell以上不出現(xiàn)透明帶破損現(xiàn)象，去除冷凍液后，胚胎也可以恢復到冷凍前狀態(tài)，但是細胞質(zhì)內(nèi)同樣出現(xiàn)微小顆粒，與羅明久等[7]的結(jié)果相同。經(jīng)培養(yǎng)后，16-cell以上的胚胎囊賠率可以達到62.5%，低于孫艷香等[8]報道的凍后發(fā)育率（91%），但是遠遠高于4-cell（0%）和8-cell（45.5%），此結(jié)果與Tao等[9]相同。

1972年Whittingham等[1]建立了緩慢冷凍法，并且第一次報道小鼠胚胎冷凍獲得成功，將胚胎置于冷凍保護劑中，利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱分階段降溫。在胚胎凍存的四個階段中：①從室溫降至誘發(fā)結(jié)晶溫度;②誘發(fā)結(jié)晶（Seeding）;③慢速（0.3 ℃ ～0.5 ℃/min）冷凍至一個中間溫度（-30 ℃ ～-35 ℃）;④快速冷凍至液氮溫度（-196 ℃）。目前，胚胎的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，體外生產(chǎn)（IVP）的胚胎低溫保存已經(jīng)取得成功[10]。隨著冷凍技術(shù)的不斷進步，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，現(xiàn)已建立了許多冷凍保存的方法，常用的有常規(guī)的緩慢冷凍法、玻璃化冷凍法和開放式拉管法等。本試驗對小鼠胚胎進行了程序化冷凍條件的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的冷凍程序?qū)π∈笈咛サ膿p傷不同，慢速冷凍的速率越快，對胚胎的損傷越大，胚胎死亡率越高，透明帶破損率越高，囊胚率越低。

參考文獻：

[1] WHITTINGHAM D G，LEIBO S P，MAZUR P.Survival of mouse embryos frozen to -196℃ and ?-206 ℃[J].Science，1972，178（59）：411-414.

[2] DONNAY I，AUQUIER P， KAIDI S ，et al.Vitrification of in vitro produced bovine blastocysts：methodological studier and developmental capacity[J].Anim Reprod Sci，1998，52：93-104.

[3] SOMMERFELD V，NIEMANN H.Cryopreservation of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezingor vitrification[J].Cryobiology，1999，38：95-105.

[4] ZHU S E，KASAI M，OTOGE H ，et al.Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions[J].J Reprod Fertil，1993，98：139-145.

[5] ALI J，SHELTON JN.Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos[J]. J Reprod Fertil，1993，99：471-477.

[6] EMILIANI S，VAN DEN BERGH M，VANNIN A S， et al.Comparison of ethylene glycol，1，2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes，4-cell embryos and blastocysts[J].Hum Reprod，2000，15：905-910.

[7] 羅明久，劉 ?娜，苗德強，等.應用乙二醇冷凍小鼠胚胎：優(yōu)化和簡化程序的探索[J].生物工程學報，2005，21（5）：766-772.

[8] 孫艷香，姜國誠，雷俊英.小鼠囊胚玻璃化冷凍保存研究[J].廣西師范大學學報，2002，20（3）：73-75.

[9] TAO J，TAMIS R，F(xiàn)INK K.Cryopreservation of mouse embryos at morula/compact stage[J].J Assist Reprod Genet，2001，18：235-243.

[10] FUKUDA Y，ICHIKAWA M，NAITO K，et al.Birth of nomal calves resulting from bovine oocytes matured，fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to blastocyst stage[J].Biol Reprod，1990，42：114-119.

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響

從表1可以看出，冷凍對不同發(fā)育階段小鼠胚胎的影響有明顯差異（P<0.05），其中解凍后胚胎（4-cell、8-cell、16-cell）發(fā)育率分別為10.0%、35.2%、84.2%;囊胚發(fā)育率（4-cell、8-cell、16-cell）分別為0%、45.5%、62.5%。

2.2 ?冷凍程序?qū)π∈笈咛サ挠绊?/p>

從表2可以看出，冷凍程序?qū)π∈笈咛ダ鋬龊笥绊戯@著（p<0.05），程序1、程序2解凍后胚胎發(fā)育率分別為84.2%、60.2%，囊胚率分別為62.5%、36.2%。

3 ?討論

胚胎冷凍是長期保存動物種質(zhì)資源的一項實用技術(shù)。胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展和應用減少了時間和空間對胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活體運輸所造成的疾病傳播。以前，小鼠和人的冷凍胚胎常用PG作為保護劑，但是最近研究證明，EG毒性較小[2-4]，并且已廣泛用于動物胚胎的慢速和玻璃化冷凍[5]。本試驗采用牛胚胎的冷凍程序[6]，同時將其冷凍和解凍程序進行簡化后對小鼠不同發(fā)育階段（4-cell、8-cell及16-cell以上）的胚胎進行了冷凍，解凍后發(fā)現(xiàn)，4-cell和8-cell胚胎有部分胚胎的透明帶已經(jīng)完全破損，雖然有的胚胎透明帶完好，但是細胞質(zhì)出現(xiàn)微小的顆粒，并且細胞間距和卵周隙增大，分析可能因為4-cell和8-cell胚胎放入冷凍液后卵裂球因脫水收縮造成;16-cell以上不出現(xiàn)透明帶破損現(xiàn)象，去除冷凍液后，胚胎也可以恢復到冷凍前狀態(tài)，但是細胞質(zhì)內(nèi)同樣出現(xiàn)微小顆粒，與羅明久等[7]的結(jié)果相同。經(jīng)培養(yǎng)后，16-cell以上的胚胎囊賠率可以達到62.5%，低于孫艷香等[8]報道的凍后發(fā)育率（91%），但是遠遠高于4-cell（0%）和8-cell（45.5%），此結(jié)果與Tao等[9]相同。

1972年Whittingham等[1]建立了緩慢冷凍法，并且第一次報道小鼠胚胎冷凍獲得成功，將胚胎置于冷凍保護劑中，利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱分階段降溫。在胚胎凍存的四個階段中：①從室溫降至誘發(fā)結(jié)晶溫度;②誘發(fā)結(jié)晶（Seeding）;③慢速（0.3 ℃ ～0.5 ℃/min）冷凍至一個中間溫度（-30 ℃ ～-35 ℃）;④快速冷凍至液氮溫度（-196 ℃）。目前，胚胎的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，體外生產(chǎn)（IVP）的胚胎低溫保存已經(jīng)取得成功[10]。隨著冷凍技術(shù)的不斷進步，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，現(xiàn)已建立了許多冷凍保存的方法，常用的有常規(guī)的緩慢冷凍法、玻璃化冷凍法和開放式拉管法等。本試驗對小鼠胚胎進行了程序化冷凍條件的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的冷凍程序?qū)π∈笈咛サ膿p傷不同，慢速冷凍的速率越快，對胚胎的損傷越大，胚胎死亡率越高，透明帶破損率越高，囊胚率越低。

參考文獻：

[1] WHITTINGHAM D G，LEIBO S P，MAZUR P.Survival of mouse embryos frozen to -196℃ and ?-206 ℃[J].Science，1972，178（59）：411-414.

[2] DONNAY I，AUQUIER P， KAIDI S ，et al.Vitrification of in vitro produced bovine blastocysts：methodological studier and developmental capacity[J].Anim Reprod Sci，1998，52：93-104.

[3] SOMMERFELD V，NIEMANN H.Cryopreservation of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezingor vitrification[J].Cryobiology，1999，38：95-105.

[4] ZHU S E，KASAI M，OTOGE H ，et al.Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions[J].J Reprod Fertil，1993，98：139-145.

[5] ALI J，SHELTON JN.Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos[J]. J Reprod Fertil，1993，99：471-477.

[6] EMILIANI S，VAN DEN BERGH M，VANNIN A S， et al.Comparison of ethylene glycol，1，2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes，4-cell embryos and blastocysts[J].Hum Reprod，2000，15：905-910.

[7] 羅明久，劉 ?娜，苗德強，等.應用乙二醇冷凍小鼠胚胎：優(yōu)化和簡化程序的探索[J].生物工程學報，2005，21（5）：766-772.

[8] 孫艷香，姜國誠，雷俊英.小鼠囊胚玻璃化冷凍保存研究[J].廣西師范大學學報，2002，20（3）：73-75.

[9] TAO J，TAMIS R，F(xiàn)INK K.Cryopreservation of mouse embryos at morula/compact stage[J].J Assist Reprod Genet，2001，18：235-243.

[10] FUKUDA Y，ICHIKAWA M，NAITO K，et al.Birth of nomal calves resulting from bovine oocytes matured，fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to blastocyst stage[J].Biol Reprod，1990，42：114-119.