国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

脂氧合酶OsRCI-1 正調(diào)控水稻對(duì)二化螟的抗性

2014-12-09 09:15姚張良曹夢(mèng)嬌繆家順沈勵(lì)澤鄧建宇吳慧明徐志宏婁永根周國(guó)鑫
環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào) 2014年4期
關(guān)鍵詞:抗蟲二化螟突變體

姚張良 ,曹夢(mèng)嬌,王 霞,繆家順,沈勵(lì)澤,鄧建宇,吳慧明,徐志宏,婁永根,周國(guó)鑫*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院植物保護(hù)系,浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江臨安,311300;2.浙江大學(xué)水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆蟲科學(xué)研究所,浙江杭州,310058)

植物脂氧合酶 LOXs (linoleate:oxygen oxidoreductase,EC1.13.11.12)將亞油酸(linoleic acid)和亞麻酸(linolenic acid)氧化成C-9 或C-13 氫過氧化物,這些物質(zhì)經(jīng)不同支路代謝生成一系列具有生物活性的脂氧化產(chǎn)物-脂氧合素(Oxylipins) (Wasternack and Hause,2013)。研究表明,植物脂氧合素(Oxylipins)在植物抵御非生物脅和生物脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用,同時(shí)一些植物脂氧合素(Oxylipins)本身就是抗蟲防御化學(xué)物質(zhì),此外Oxylipins 也在植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官形態(tài)建成、開花繁殖中具有重要作用(Demmig-Adams et al.,2013)。其中,茉莉酸(Jasmonic acid,JA) 和綠葉 氣味分 (Green leaf volatiles,GLVs)是近二十年來植物抗蟲防御反應(yīng)中研究的較多、較深入的2種植物脂氧合素(Oxylipins),這兩類物質(zhì)雖然其本身沒有殺蟲活性,但可作為信號(hào)分子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗蟲免疫防御反應(yīng)(Demmig-Adams et al.,2013)。研究表明,植物脂氧合酶(LOXs)是茉莉酸(JA)和綠葉性氣味分子(GLVs)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(Wasternack and Hause,2013)。

在植物中,脂氧合酶由一個(gè)基因家族編碼,家族中各LOX 基因表達(dá)模式、催化特性、生物學(xué)功能存在巨大差異。不同的LOX 基因催化產(chǎn)物往往只用于特定的代謝支路,如玉米ZmLOX8 和ZmLOX10 定位于不同的亞細(xì)胞器中,分別特異性地為茉莉酸 (JA)途徑和綠葉性氣味分子(GLVs)生物合成提供底物 (Christensen et al.,2013)。雖然4 個(gè)擬南芥13-LOX 基因AtLOX2、AtLOX3、AtLOX4 和AtLOX6 都參與機(jī)械損傷誘導(dǎo)的茉莉酸合成,但是只有AtLOX6 是擬南芥葉片應(yīng)答遠(yuǎn)距離機(jī)械損傷信號(hào)誘導(dǎo)早期茉莉酸積累所必須的(Chauvin et al.,2013)。可見,家族中各LOX基因編碼蛋白的生化活性、生物學(xué)功能存在巨大差異。

與擬南芥、煙草、玉米等相似,水稻脂氧合酶基因家族也由多個(gè)基因成員組成,水稻基因組至少存在15 個(gè)LOX 基因(Agrawal et al.,2004)。已有的研究表明,水稻LOX 基因成員的生物學(xué)功能存在多樣性,不同LOX 基因分別在糧食陳化、抗病蟲中起著重要作用。水稻種子中有3 個(gè)脂氧合酶同工酶sLOX-1、sLOX-2 和sLOX-3,缺失sLOX-1 或sLOX-2 的水稻種子陳化速度顯著減慢;缺失sLOX-3 水稻種子對(duì)陳化速度沒有影響,但是缺失sLOX-3 水稻不易吸引谷蠹Rhizopertha dominica 為害(Zhang et al.,2007)。

在水稻脂氧合酶基因調(diào)控水稻抗蟲誘導(dǎo)防御反應(yīng)方面,Wang 等2008年報(bào)道OsLOX1 具有C9/13-LOX活性,參與水稻體內(nèi)茉莉酸(JA)和綠葉性氣味分子(GLVs)的生成,正調(diào)控對(duì)褐飛虱的抗性。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)OsHI-LOX 僅具有C13-LOX 活性,其參與蟲害誘導(dǎo)的茉莉酸(JA)合成,但不參與水稻綠葉性氣味(GLVs)的釋放(Zhou et al.,2009)。非常有趣的是,反義抑制OsHI-LOX 突變體削弱了機(jī)械損傷和昆蟲取食誘導(dǎo)的JA 合成,降低對(duì)咀嚼式口器昆蟲二化螟Chilo suppressalia Walker 和稻縱葉螟Cnaphalocrosis medinalis Guenee 的抗性,但是卻增加了對(duì)刺吸式口器昆蟲褐飛虱(Nilaparvata lugens St?l)的抗性(Zhou et al.,2009)。我們最近的研究表明Osr9-LOX1 是一個(gè)僅有C9 催化活性的脂氧合酶,反義抑制Osr9-LOX1 基因突變體植株as-r9lox1 表現(xiàn)為更加抗二化螟,Osr9-LOX1 可以通過調(diào)控13-LOX 途徑影響水稻對(duì)昆蟲的誘導(dǎo)抗性(Zhou et al.,2014)。研究表明,水稻LOX 基因家族中有8 個(gè)成員被二化螟取食脅迫調(diào)控(Zhou et al.,2011),其中OsHI-LOX、OsLOX1 和Osr9-LOX1 的抗蟲功能已被較好的研究(Wang et al.,2008;Zhou et al.,2009;Zhou et al.,2014)。可見,水稻脂氧合酶家族基因生物功能存在差異,在蟲害誘導(dǎo)的水稻防御反應(yīng)中扮演不同的角色。

水稻是重要的糧食作物,世界上一半以上的人口以水稻為主糧(Cheng et al.,2013)。在我國(guó),水稻是最主要的糧食作物,水稻生產(chǎn)直接關(guān)系到我國(guó)的糧食安全。二化螟 (Striped stem borer,SSB)是水稻的主要害蟲之一。本文克隆了一個(gè)蟲害脅迫誘導(dǎo)水稻LOX 基因OsRCI-1,研究了其在二化螟取食為害后的時(shí)序表達(dá)譜;并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了OsRCI-1 基因沉默水稻突變體ir-rci;利用獲得的突變體,檢測(cè)了水稻OsRCI-1 基因?qū)ΧL(zhǎng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 水稻品種和實(shí)驗(yàn)昆蟲

供試水稻品種為秀水11 (XS11)及OsRCI-1的RNA 干擾基因沉默株系ir-rci。水稻種子于光照培養(yǎng)箱催芽后,移入組培瓶(直徑6.5 cm,高9.0 cm),置于溫室(溫度28±2℃,濕度60%±10%,光照L∶D=16∶8)培養(yǎng)10 d,后移栽到盛土的塑料杯中,每杯移栽1 株。移栽的水稻苗在溫室(溫度28±2℃、濕度60%±10%、光照L∶D=16∶8)中生長(zhǎng),每天澆水,每周施濃度1 g/L的尿素水溶液10 mL,35-40 d 后用于各種實(shí)驗(yàn)。

二化螟幼蟲采自中國(guó)水稻研究所農(nóng)場(chǎng)(浙江富陽),在室內(nèi) (溫度26± 2℃、濕度70%±10%、光照L∶D=18∶6),以Taichung Native 1(TN1)水稻幼苗飼養(yǎng)和繁殖至少1 代后用于各種實(shí)驗(yàn)。

1.2 二化螟取食為害后的水稻脂氧合酶基因表達(dá)分析

移栽后35-40 d 水稻XS11 用自來水沖洗干凈,每株水稻莖桿接饑餓2 h 的二化螟3 齡幼蟲1頭,待二化螟鉆入水稻莖桿1/2 體長(zhǎng)開始計(jì)時(shí),在二化螟為害后0、0.5、1、2、4、8、12、24 和48 h 剪下二化螟為害處2-3 cm 長(zhǎng)水稻莖桿,迅速除去二化螟幼蟲,立即放液氮冷凍,后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA 用SV Total RNA Isolation System(Promega)試劑盒提取,具體方法參照試劑盒說明書。100 ng 總RNA 以ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)試劑盒合成cDNA,具體方法參照試劑盒說明書。蟲害誘導(dǎo)水稻脂氧合酶基因OsHI-LOX 2(LOC _ Os03g52860)、OsHI-LOX 3 (LOC _Os08g39850)和OsRCI-1 (LOC_ Os12g37260)表達(dá)豐度檢測(cè)以TaqMAN 定量PCR 法進(jìn)行,以O(shè)sACT 基因(LOC_ Os03g50885)作為內(nèi)參基因,定量PCR 所用試劑盒為Premix Ex TaqTM Kit(TaKaRa),所用引物及探針序列見表1。

表1 QRT-PCR 引物及探針Table 1 Primers and probes used for QRT-PCR of target genes

1.3 水稻OsRCI-1 基因的克隆和序列分析

根據(jù) TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫中LOC_ Os12g37260 的序列設(shè)計(jì)特異性引物RCI-F:5'-ATGCTCACGGCCACGCACGCA GACTC-3'和RCI-R:5'-TCAAATTGAGATG CTGTTGGGGA-3'。PCR 反應(yīng)總 積20 μL:cDNA 1 μL,特異性引物各1 μL,dNTP 2 μL,2×buffer 10 μL,PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TakaRa)0.2 μL,ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?98℃10 s,50℃1 min,68℃3 min,5 次循環(huán);98℃10 s,72℃3 min,35 次循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增出目的片段,用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen)割膠試劑盒回收,后經(jīng)加A 后連接入pGEM-T Easy (Promega)載體,挑選4 個(gè)陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序鑒定。序列用Prosite 軟件(http://www.expasy.org/)和NetPhosK 1.0 軟件 (http://www.cbs.dtu.dk)進(jìn)行蛋白基序(Motif)、功能結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)分析。

1.4 RNAi 載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

OsRCI-1 基因的特異性片段分別正向和反向連接入植物表達(dá)載體內(nèi)含子(intron)的兩端,組合的編碼序列置于CaMV 35S 啟動(dòng)子和NOS 終止子之間以獲得一個(gè)完整的RNAi 表達(dá)框。正向序列插入,根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物iRC +F:5'-ATGGTCGACCGCCCCTTCTTCCTTCTCCA-3',iRC +R:5'-CTTGGTACCGTCCTGCTTCAAGCTCA CCGT-3' (下劃線分別是SalI 和KpnI 的酶切位點(diǎn));以獲得的OsRCI 質(zhì)粒為模板,反應(yīng)為體系20 μL (特異性引物各1 μL,dNTP 2 μL,2×buffer 10 μL,PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0.2 μL,ddH2O 補(bǔ)足),反應(yīng)程序 (98℃ 10 s,66℃ 20 s,反應(yīng)循環(huán)35 次,最后72℃延伸5 min),擴(kuò)增出的217 bp 目的片段,電泳割膠回收后經(jīng)SalI 和KpnI 雙酶切后與經(jīng)同樣內(nèi)切酶消化的載體連接,構(gòu)建的載體經(jīng)酶切及測(cè)序驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上,以特異性引物 iRC-F:5'-CTAGGATCCCGCCCCTTCTTCCTTCTCCA-3',iRC-R:5'-GACTCTAGAGTCCTGCTTCAAGC TCACCGT-3' (下劃線分別是BamHI 和XbaI 的酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增出目的片段,電泳割膠回收經(jīng)BamHI 和XbaI 雙酶切后克隆進(jìn)載體的XbaI 和BamHI 的位點(diǎn),篩選陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序確定。

構(gòu)建的OsRCI-1 基因的RNAi 植物表達(dá)載體pRNAi-RCI 質(zhì)粒1 μg 采用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌工程菌株EHA105,陽性克隆經(jīng)PCR 及測(cè)序鑒定,獲得含質(zhì)粒pRNAi-RCI 的工程農(nóng)桿菌用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化參考Hier 等的方法進(jìn)行(Hiei et al.,1994)。含pRNAi-RCI 質(zhì)粒的工程農(nóng)桿菌單克隆接種于YEP 液體培養(yǎng)基,于28℃,250 rpm 條件下在溫控?fù)u床培養(yǎng)至OD=0.5,菌液離心后以侵染培養(yǎng)基重懸獲得侵染用菌液,將水稻XS11 成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織置于侵染菌液30 min 后,取出愈傷組織在濾紙上晾干后放置共培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2 d;之后,將愈傷組織置含潮霉素的抗性培養(yǎng)基上篩選,獲得的抗性愈傷經(jīng)預(yù)分化、分化、生根后獲得OsRCI-1 的RNAi突變體水稻。

1.5 OsRCI-1 的RNAi 突變體目的基因OsRCI-1沉默效果監(jiān)測(cè)

因?yàn)檐岳蛩崮苷T導(dǎo) OsRCI-1 的表達(dá)(Schaffrath et al.,2000)。對(duì)野生型XS11 和突變體植株ir-rci 水稻均勻噴灑2 mL 茉莉酸溶液(100 μg/mL),處理6 h 后,剪取倒數(shù)第2 完全伸展葉,立即浸入液氮冷凍后置-80℃冰箱保存。植物總RNA 提取、cDNA 合成以及定量PCR 見方法材料與方法1.2。

1.6 二化螟的生物測(cè)定

野生型XS11 和突變體植株ir-rci,每株接入二化螟2 頭初孵幼蟲,將接蟲后的水稻放入人工氣候室內(nèi)(溫度28±2℃、濕度60%±10%、光照L∶D=16∶8)繼續(xù)培養(yǎng),13 d 后從各株水稻中剝出二化螟并稱重,各處理至少30 個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析原理,對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Statistica 6.0 (StatSoft)軟件進(jìn)行t-test檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲害誘導(dǎo)水稻LOX 基因在二化螟取食后的時(shí)序表達(dá)特征

圖1 二化螟處理水稻莖桿水稻LOX 基因的表達(dá)特征Fig.1 Relative expression levels of three herbivore-induced riceLOX in SSB-infested rice plants

本研究選擇3 個(gè)受蟲害誘導(dǎo)LOX 基因(Zhou et al.,2011),并對(duì)其mRNA 表達(dá)特征進(jìn)行了分析(如圖1)。結(jié)果表明,3 個(gè)受蟲害誘導(dǎo)的水稻脂氧合酶中,OsHI-LOX 2 (LOC_ Os03g52860) (圖1A)在水稻莖桿中的相對(duì)表達(dá)量較高,而OsHI-LOX 3 (LOC_ Os08g39850) (圖1B)相對(duì)表達(dá)量最低。二化螟取食處理都能顯著地誘導(dǎo)這3 個(gè)LOX基因的表達(dá),其中OsHI-LOX 2 (圖1A)和OsHI-LOX 3 (圖1B)分別在二化螟取食8 h 和4 h 后mRNA 水平開始顯著積累,并且之后一直持續(xù)不斷增加。而OsRCI-1 (LOC_ Os12g37260)表達(dá)水平與0h 對(duì)照相比,二化螟處理后0.5 h 即顯著地增加,隨著二化螟取食時(shí)間推移其表達(dá)量不斷的積累(圖1C),說明該基因在二化螟取食初期即對(duì)防御信號(hào)作出了應(yīng)答,并一直保持較高的表達(dá)水平,因此我們選擇該基因作進(jìn)一步研究。

2.2 水稻OsRCI-1 基因的克隆和序列分析

圖2 OsRCI-1 基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis analysis ofOsRCI-1 PCR product

以RCI-F 和RCI-R 為引物,用高保真DNA Taq 酶擴(kuò)增出一條約2800 bp 的特異性條帶(如圖2)。割膠回收該條帶,連接入pGEM-T easy 克隆載體,挑選4 個(gè)陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得2769 bp 序列(圖3),推測(cè)編碼922 個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)編碼蛋白分子量為105 kDa。序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)其基因序列與日本栽培稻(Kusabue)的OsRCI-1 基因(AJ270938)序列完全一致。ExPASy 網(wǎng)站Prosite 軟件進(jìn)行蛋白功能域掃描,發(fā)現(xiàn)了編碼的蛋白只有LIPOXYGENASE 一個(gè)Motif (如圖3A),表明克隆的OsRCI-1 具有脂氧合酶(lipoxygenase)的功能。蛋白磷酸化在水稻抗蟲防御信號(hào)傳導(dǎo)中起非常重要的作用,因此用NetPhosK 1.0 軟件對(duì)OsRCI-1 蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)有13 個(gè)位點(diǎn)可被蛋白激酶PKC所磷酸化(表2)。

表2 OsRCI-1 蛋白可被PKC 蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)Table 2 The putative phosphorylation site of OsRCI-1 by protein kinase PKC

2.3 載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

為了進(jìn)一步明確OsRCI-1 的抗蟲功能,我們?cè)O(shè)計(jì)了引物擴(kuò)增出一段217 bp 的OsRCI-1 特異性片段(圖3 下劃線序列),分別正向和反向插在內(nèi)含子(intron)的兩端,構(gòu)成目的基因片段互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖4),將該發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)置于CaMV35 啟動(dòng)子和NOS 終止子之間,構(gòu)建沉默OsRCI-1 的RNAi 植物表達(dá)載體pRNAi-RCI。RNAi 載體pRNAi-RCI 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,陽性克隆經(jīng)菌落PCR 驗(yàn)證后,用于水稻胚性愈傷侵染。獲得的抗性愈傷經(jīng)潮霉素抗性篩選、分化和生根,獲得RNAi 的水稻株系用于后續(xù)研究(圖5)。

圖3 克隆的OsRCI-1 基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列及其結(jié)構(gòu)域Fig 3 Sequence ofOsRCI-1 and its deduced amino acid sequence and it’s motif

圖4 水稻基因RCI-1 沉默原理Fig.4 The rice geneRCI-1 silencing principle

圖5 轉(zhuǎn)基因突變體的獲得Fig.5 Construction of transgenic plants

2.4 突變體株系中目的基因表達(dá)被顯著抑制

為了明確RNAi 突變體株系中目的基因OsRCI-1 的轉(zhuǎn)錄水平,我們利用QRT-PCR 對(duì)RNAi 突變體株系ir-rci-1 和ir-rci-2 進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,這兩個(gè)株系中OsRCI-1 基因的表達(dá)量顯著降低,ir-rci-1 和ir-rci-2 中目的基因表達(dá)豐度分別只有野生型XS11 表達(dá)量的47.73% 和32.33% (如圖6)。

圖6 突變體ir-rci 和野生型中OsRCI-1 基因的相對(duì)表達(dá)量(n=5;*,P<0.05,t-test)Fig.6 The relative expression level ofOsRCI-1 gene in ansgenic rice plants and WT line (n=5;*,P<0.05,t-test)

2.5 抑制OsRCI-1 表達(dá)降低水稻對(duì)二化螟直接抗性

為了明確RNAi 的兩個(gè)株系ir-rci-1 和ir-rci-2 對(duì)二化螟生長(zhǎng)發(fā)育的影響,測(cè)定了二化螟初孵幼蟲在野生型水稻和RNAi 突變體ir-rci 株系的生長(zhǎng)情況。在接入二化螟初孵幼蟲13d 后,剝出二化螟稱重,結(jié)果表明取食ir-rci-1 和ir-rci-2株系的二化螟的體重分別為取食野生型XS11 的1.58 倍和2.15 倍(圖7 A)。野生型水稻對(duì)二化螟取食為害的耐害能力明顯比ir-rci 品系要強(qiáng),二化螟為害13d 后兩個(gè)突變體品系ir-rci 生長(zhǎng)被完全抑制,表現(xiàn)為枯心并且外側(cè)葉子枯黃,而野生型水稻僅外葉鞘發(fā)黃(如圖7B)。

3 結(jié)論與討論

圖7 突變體ir-rci 和野生型XS11 水稻對(duì)二化螟的抗性Fig.7 The resistance of ir-rci lines and WT plants to SSB infestation

本研究用QRT-PCR 檢測(cè)了水稻3 個(gè)脂氧合酶基因OsHI-LOX 2/LOC_ Os03g52860、OsHI-LOX 3/LOC_ Os08g39850 和 OsRCI-1/LOC _Os12g37260 在二化螟取食后的表達(dá)動(dòng)態(tài),結(jié)果表明3 個(gè)基因均被二化螟取食脅迫信號(hào)所誘導(dǎo),該結(jié)果與Zhou 等2011年的結(jié)論一致(Zhou et al.,2011)。此外,這3 個(gè)水稻LOX 基因雖然都能被二化螟取食誘導(dǎo),但是其誘導(dǎo)表達(dá)動(dòng)態(tài)存在差異,表明這3 個(gè)LOX 基因可能在水稻誘導(dǎo)抗蟲防御反應(yīng)中存在差異。其中,OsRCI-1 基因表現(xiàn)出對(duì)二化螟取食信號(hào)快速及持續(xù)應(yīng)答反應(yīng),我們推測(cè)該基因可能在水稻對(duì)二化螟的防御反應(yīng)中起重要的作用,并對(duì)該基因進(jìn)行了詳細(xì)研究。從秀水11 水稻品種中克隆的OsRCI-1 經(jīng)測(cè)序與日本栽培稻(Kusabue)的OsRCI-1 基因序列完全一致。前人的研究表明,用植物獲得性抗性誘導(dǎo)化合物benzol(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH)和2,6-dichloroisonicotinic acid (INA)處理均能誘導(dǎo)水稻體內(nèi)OsRCI-1 的積累(Schaffrath et al.,2000)。并且過量表達(dá)OsRCI-1 基因,會(huì)導(dǎo)致水稻葉片病程相關(guān)蛋白OsPR1 的積累(Zabbai et al.,2004),說明OsRCI-1 基因可能與水稻抗病性密切相關(guān)。機(jī)械損傷處理不能誘導(dǎo)OsRCI-1 表達(dá)(Schaffrath et al.,2000),但能被二化螟取食所誘導(dǎo)(圖1),說明OsRCI-1 是二化螟取食脅迫信號(hào)調(diào)控的特異性基因,能特異識(shí)別二化螟取食所釋放的特異誘導(dǎo)信號(hào)。OsRCI-1 是定位于葉綠體13-LOX 催化活性脂氧合酶,用該信號(hào)途徑的產(chǎn)物茉莉酸處理能顯著增加水稻葉片OsRCI-1 表達(dá) (Schaffrath et al.,2000;Zabbai et al.,2004),水稻中OsRCI-1 介導(dǎo)的防御反應(yīng)途徑可能存在一個(gè)正反饋調(diào)控的機(jī)制。

RNAi 抑制OsRCI-1 基因表達(dá),導(dǎo)致水稻對(duì)二化螟的抗性減弱,植物的耐害性降低,OsRCI-1 沉默的兩個(gè)株系ir-rci-1 和ir-rci-2 明顯的對(duì)二化螟取食更加敏感(圖7)。這一結(jié)果與我們先前研究水稻13-LOX 基因OsHI-LOX 正調(diào)控對(duì)二化螟抗性的功能相類似(Zhou et al.,2009),但是OsRCI-1 催化產(chǎn)物是否供給水稻體內(nèi)茉莉酸(JA)或綠葉性氣味(GLVs)合成還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。與水稻OsHI-LOX 和OsRCI-1 相反,水稻Osr9-LOX1 基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)二化螟的抗性,并且Osr9-LOX1 是通過調(diào)控13-LOX 途徑影響水稻對(duì)昆蟲的誘導(dǎo)抗性 (Zhou et al.,2014)。反義抑制OsHI-LOX 基因突變體植株aslox 表現(xiàn)為對(duì)二化螟更加敏感是由于as-lox 中蟲害誘導(dǎo)茉莉酸合成受到抑制,導(dǎo)致抗蟲物質(zhì)蛋白酶抑制劑(TrypPIs)合成減少(Zhou et al.,2009)。OsRCI-1 的RNAi 水稻突變體ir-rci 對(duì)二化螟取食表現(xiàn)為更加敏感,是否也是由于蟲害誘導(dǎo)茉莉酸合成減少導(dǎo)致抗蟲防御物質(zhì)TrypPI 含量降低,即OsRCI-1 基因介導(dǎo)的水稻誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

References)

Agrawal GK,Tamogami S,Han O,et al.Rice octadecanoid pathway[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,(317)1:1-15.

Chauvin A,Caldelari D,Wolfender JL,et al.Four 13-lipoxygenases contribute to rapid jasmonate synthesis in wounded Arabidopsis thaliana leaves:a role for lipoxygenase 6 in responses to long-distance wound signals [J].New Phytologist,2013,(197)2:566-575.

Cheng XY,Zhu LL,He GC.Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper [J].Molecular Plant,2013,(6)3:621-634.

Christensen SA,Nemchenko A,Borrego E,et al.The maize lipoxygenase,ZmLOX10,mediates green leaf volatile,jasmonate and herbivore-induced plant volatile production for defense against insect attack [J].Plant Journal,2013,(74)1:59-73.

Demmig-Adams B,Cohu CM,Amiard V,et al.Emerging trade-offs-impact of photoprotectants (PsbS,xanthophylls,and vitamin E)on oxylipins as regulators of development and defense [J].New Phytologist,2013,(197)3:720-729.

Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al.Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA [J].Plant Journal,1994,(6)2:271-282.

Schaffrath U,Zabbai F,Dudler R.Characterization of RCI-1,a chloroplastic rice lipoxygenase whose synthesis is induced by chemical plant resistance activators [J].European Journal of Biochemistry,2000,(267)19:5935-5942.

Wang R,Shen W,Liu L,et al.A novel lipoxygenase gene from developing rice seeds confers dual position specificity and responds to wounding and insect attack [J].Plant Molecular Biology,2008,(66)4:401-414.

Wasternack C,Hause B.Jasmonates:biosynthesis,perception,signal transduction and action in plant stress response,growth and development.An update to the 2007 review in Annals of Botany[J].Annals of Botany,2013,(111)6:1021-1058.

Zabbai F,Jarosch B,Schaffrath U.Over-expression of chloroplastic lipoxygenase RCI1 causes PR1 transcript accumulation in transiently transformed rice [J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2004,(64)1:37-43.

Zhang Y,Yu Z,Lu Y,et al.Effect of the absence of lipoxygenase isoenzymes on the storage characteristics of rice grains [J].Journal of Stored Products Research,2007,(43)1:87-91.

Zhou G,Qi J,Ren N,et al.Silencing OsHI-LOX makes rice more susceptible to chewing herbivores,but enhances resistance to a phloem feeder [J].Plant Journal,2009,(60)4:638-648.

Zhou G,Ren N,Qi J,et al.The 9-lipoxygenase Osr9-LOX1 interacts with the 13-lipoxygenase-mediated pathway to regulate resistance to chewing and piercing-sucking herbivores in rice[J].Physiologia Plantarum,2014,doi:10.1111/ppl.12148.

Zhou G,Wang X,Yan F,et al.Genome-wide transcriptional changes and defence-related chemical profiling of rice in response to infestation by the rice striped stem borer Chilo suppressalis [J].Physiologia Plantarum,2011,(143)1:21-40.

猜你喜歡
抗蟲二化螟突變體
不同形態(tài)指標(biāo)用于二化螟幼蟲齡期劃分的研究
應(yīng)用赤眼蜂防治水稻二化螟的效果評(píng)價(jià)
歐黑抗蟲楊N12對(duì)美國(guó)白蛾的抗蟲性研究
稻蝦共作模式對(duì)稻田二化螟的影響
尿黑酸對(duì)擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
省農(nóng)委召開水稻二化螟航化放蜂防治技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)培訓(xùn)會(huì)
一個(gè)粳稻早熟突變體的遺傳分析及育種應(yīng)用潛力的初步評(píng)價(jià)
陳曉亞院士課題組發(fā)現(xiàn)植物抗蟲調(diào)控新機(jī)制
基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt抗蟲基因轉(zhuǎn)化芥藍(lán)
CLIC1及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白的共定位研究