胡素麗，王立婷，丘雪紅，顏 珣，張建萍，韓日疇＊＊

(1.石河子大學農(nóng)學院植物保護系，新疆石河子 832003;2.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260)

異小桿屬Heterorhabditis 和斯氏屬Steinernema昆蟲病原線蟲分別與發(fā)光桿菌屬Photorhabdus 和致病桿菌屬Xenorhabdus 細菌互惠共生，是國際上新型的高效生物殺蟲劑。這類線蟲具有殺蟲能力強，殺蟲譜廣，能主動搜索寄主，對人畜、環(huán)境安全等優(yōu)點(Georgis et al.，2006)。昆蟲病原線蟲之所以能致死昆蟲，其體內攜帶的共生細菌起了關鍵作 用 (Poinar and Thomas，1966;Poinar et al.，1977)。在昆蟲病原線蟲的商業(yè)化生產(chǎn)過程中，無菌線蟲與共生菌組成單菌培養(yǎng)體系，共生菌為線蟲的發(fā)育繁殖建立理想環(huán)境并提供營養(yǎng)。因此，選擇合適的共生細菌對這類生物殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)極為重要。

線蟲與細菌的共生關系主要體現(xiàn)在4 方面的?；?信息?；裕醇毦T導感染期線蟲恢復發(fā)育的?；?Han and Ehlers，1998;Strauch and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003);營養(yǎng)?；?，即細菌將昆蟲組織或培養(yǎng)基組分轉化為支持線蟲生長、繁殖的營養(yǎng)物質的?；?Akhurst，1983;Sicard et al.，2003;Mitani et al.，2004);定殖?；裕醇毦ㄖ秤诟腥酒诰€蟲腸道的?；?Han and Ehlers，1998;Martens and Goodrich-Blair，2005;Snyder et al.，2007);種間特異殺線蟲專化性，即昆蟲病原線蟲與非特異共生的共生菌組合培養(yǎng)時，一些共生菌可以產(chǎn)生殺線蟲毒素殺死非特異性共生線蟲寄主的?；?Han and Ehlers，1998，1999，2001)。

本文通過構建P.luminescens LN2 的Tn5 轉座突變庫，獲得了可促進H.indica LN2 線蟲生長的突變菌株，同時，測定了該突變菌株的菌落特征、對昆蟲毒性以及H.bacteriophora H06 線蟲的致死作用。

1 材料和方法

1.1 實驗昆蟲、線蟲品系、細菌菌株與質粒

實驗采用的線蟲品系、細菌菌株和質粒見表1。大蠟螟末齡幼蟲由廣東省昆蟲研究所資源昆蟲與生物工程研究中心飼養(yǎng)。

表1 實驗線蟲品系、細菌菌株與質粒Table 1 Nematode and bacteria strains and plasmids used in this study

1.2 細菌與線蟲的培養(yǎng)

Photorhabdus 屬細菌及大腸桿菌E.coli 均采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為28℃和37℃?？股氐氖褂脻舛?卡那霉素(Km)為50 μg/mL、氨芐青霉素(Am)為100 μg/mL、硫酸鏈霉素(Sm)為50 μg/mL。

H.indica LN2 與H.bacteriophora H06 線蟲采用海綿培養(yǎng)基于23℃條件下進行體外培養(yǎng)(Wouts，1981;Han et al.，1992)。無菌的H06 與LN2 感染期線蟲分別通過將無菌的H.bacteriophora H06 線蟲與非專化性共生的P.luminescens HNA 細菌，H.indica LN2 線蟲與非?；怨采腜.luminescens H06 細菌建立單菌組合培養(yǎng)獲得(Han and Ehler，1998;丘雪紅等，2004)。

1.3 P.luminescens LN2 轉座突變子庫構建和突變菌株篩選

為了方便檢測，本文將pRL1063a 質粒中的luxAB 基因替換成含自身啟動子的egfp 基因，構建了重組質粒pRL1063a-egfp。采用三親本雜交方法，以DH5α/pRL1063a-egfp 為供體菌、DH5α/pRK2013 為輔助菌、P.luminescens LN2-A 為受體，將攜帶Tn5-egfp 的質粒pRL1063a-egfp 導入LN2-A，于LB 平板(Am，Km)上獲得突變菌株約13000 株。

于96 孔細胞培養(yǎng)板的LB 培養(yǎng)基(含1.8%瓊脂，加入相應抗菌素)上測定促進LN2 線蟲生長的突變菌株(Han and Ehlers，1998)。具體方法如下:將野生型與各突變菌株均勻涂于測定平板中，25℃培養(yǎng)48 h 后，往每個測定孔中加入10 μL 無菌LN2 感染期線蟲(150 IJs)，25℃靜置培養(yǎng)。每天觀察并記錄線蟲的生長發(fā)育情況。每個處理設3 個孔的重復。對于影響線蟲生長發(fā)育的突變菌株，整個測定至少重復3 次。

1.4 突變菌株LN2-M2716 的Tn5 插入驗證

本實驗獲得影響LN2 線蟲生長發(fā)育的突變菌株LN2-M2716。采用PCR 與Southern blot 方法驗證突變菌株中Tn5 的插入及其拷貝數(shù)。即選擇在Tn5-lac-egfp 內沒有酶切位點的限制性內切酶Spe I 對野生型LN2-W 及突變株LN2-M2716 基因組DNA 及pRL1063a-egfp 質粒進行酶切，其中pRL1063a-egfp 質粒作為陽性對照，野生型LN2-W 作為陰性對照，以Tn5-lac-egfp 內的Km 片段為探針進行Southern 雜交。

1.5 LN2-M2716 的菌落特征

將野生型菌株及突變菌株，涂布在NBTA(Akhurst，1980)和MacConkey 平板上，28℃培養(yǎng)2-3 d，觀察菌落的形態(tài)、顏色及熒光發(fā)生情況。以接種環(huán)蘸取于LB 平板上生長了2 d 的菌落，以菌落能否拉絲來判斷粘性。

過氧化氫酶活性測定:在滅菌的培養(yǎng)皿中滴加50 μL 3%的H2O2，用接種針挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮單菌落，涂布在液體中央，觀察是否有氣泡出現(xiàn)和氣泡出現(xiàn)的強烈程度。

1.6 LN2-M2716 上清液對H.indica LN2 感染期線蟲恢復發(fā)育的影響

將培養(yǎng)了24 h 的野生型菌株LN2 和突變菌株LN2-M2716 菌液以液體LB 調至OD600后，以1∶100 接入新 LB 液體培基中，28℃，200 rpm 培養(yǎng)24 h 至OD600約為2.0。14000 g，4℃離心10 min，取上清液以0.25 μm 濾膜(Pall 公司)過濾除菌。取48 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μL 上清過濾液，10 μL 無菌LN2 感染期線蟲液(150 IJs)，25℃，100 rpm 振蕩培養(yǎng)。分別于0，1 d，2 d，3 d，4 d，6 d，8 d 取5 孔的樣品于顯微鏡下觀察并記錄線蟲恢復發(fā)育和死亡情況。

1.7 LN2-M2716 對H.indica LN2 線蟲生長的影響

測定方法與材料與方法1.3類似，測定板采用48 孔細胞培養(yǎng)板。分別取3 μL 培養(yǎng)了24 h 的野生型菌株LN2-W 和突變菌株LN2-M2716 的菌液涂布相應的測定板中，28℃培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL 無菌LN2 感染期線蟲液(150 IJs)。加入線蟲后的培養(yǎng)板置于25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)32 h、68 h、122 h、8 d、12 d 后，以Ringer's 緩沖液(1 L 溶液中含:NaCl 8 g，CaCl20.2 g，KCl 0.2 g，NaHCO30.2 g)沖洗培養(yǎng)基至全部線蟲洗出，取樣觀察線蟲生長發(fā)育情況。每個處理設5 孔重復。

1.8 LN2-M2716 對H.bacteriophora H06 線蟲的毒性

測定方法同1.7。測定菌株除野生型菌株LN2-W 和突變菌株LN2-M2716 外，添加P.luminescens H06 野生菌株作為陽性對照。測定線蟲為無菌H.bacteriophora H06 感染期線蟲。分別于線蟲與細菌共培養(yǎng)2 d、4 d、6 d、8 d 后，以Ringer's 緩沖液沖洗培養(yǎng)基至全部線蟲洗出，取樣觀察線蟲存活、生長發(fā)育情況。每個處理設5 孔重復。

1.9 LN2-M2716 對大蠟螟的注射毒力

LN2-M2716 菌株以LB 培養(yǎng)至OD600約為2.0，于6000 rpm，10℃下離心10 min 收集菌體，并用無菌PBS (1 L 溶液中含:NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KHPO40.24 g;pH7.4)清洗3 次，最后用PBS 稀釋至細菌濃度為10、100、1000、2000 CFU/μL 用于注射大蠟螟。取均重為387 mg 的大蠟螟末齡幼蟲，冰上放置5 min后，以10 μL 的注射量將不同濃度的菌液從大蠟螟幼蟲的第一對腹足注入昆蟲體內，每頭昆蟲注射10 μL 無菌PBS 作為對照。每重復10 頭幼蟲，每處理3 個重復。注射后的昆蟲置于25℃培養(yǎng)。24 h 后，每6 h 檢查昆蟲的死亡率，以針刺激昆蟲不動為死亡。死亡的昆蟲如能變紅并發(fā)出熒光則認為被共生細菌致死。

1.10 LN2-M2716 對LN2 線蟲固體培養(yǎng)產(chǎn)量的影響

為了測定突變菌株對線蟲產(chǎn)量的影響，于500 mL三角瓶中加入70 g 海綿培養(yǎng)基(Han and Ehlers，1998)，將7 mL 野生型與突變菌株的24 h培養(yǎng)液分別接入培養(yǎng)基中，搖勻培養(yǎng)基以確保共生細菌均勻分布。培養(yǎng)瓶于23℃培養(yǎng)2 d 后接入3 mL無菌H.indica LN2 感染期線蟲液 (3.0×104IJs/mL)。培養(yǎng)8 d，16 d，21 d，26 d，31 d后，分別隨機取3 個培養(yǎng)瓶，于0.9% NaCl 溶液中浸泡清洗3 次以上，收集線蟲并稀釋至合適的倍數(shù)，于解剖鏡下觀察并計數(shù)感染期線蟲的數(shù)量。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

百分數(shù)值數(shù)據(jù)均經(jīng)反正弦變換后，以SPSS16.0 軟件進行配對樣品t 檢驗，方差分析P＜0.05 時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 突變菌株篩選與Tn5 插入驗證

利用Tn5-lac-egfp 對P.luminescens LN2 進行隨機插入突變，獲得13000 個突變株。通過生物測定篩選獲得1 個影響線蟲生長發(fā)育的突變菌株，定名為LN2-M2716。

分別以突變株LN2-M2716 基因組DNA 和pRL1063a-egfp 質粒為模板，以轉座子Tn5 內部的序列設計引物 (Tn5-Km-for:5'-ATGATTGAACAAGATGGATT-3'和Tn5-Km-rev:5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3')進行PCR擴增，所得PCR 產(chǎn)物測序結果證實Tn5 已經(jīng)轉座到LN2-M2716 基因組中。

Southern 雜交結果顯示，突變株和pRL1063a-egfp 質粒在相應位置各出現(xiàn)了1 條陽性帶，而野生型菌沒有條帶(圖1)，表明Tn5 在突變菌株基因組中只有單一位點的插入。

圖1 野生型菌株LN2-W 及其突變菌株LN2-M2716 基因組DNA Spe I 酶切后與Km 探針的Southern blot 圖譜Fig.1 Southern blotting analysis of wild type strain LN2-W and mutant LN2-M2716 genomic DNA digested by Spe I

2.2 LN2-M2716 的菌落特征

28℃培養(yǎng)36-48 h 后，野生型LN2 菌株和突變菌株LN2-M2716 的菌落在NBTA 平板上呈藍綠色，在MacConkey 平板上呈紅色;黑暗中可見菌落產(chǎn)生強烈熒光;菌落具有較強粘性;過氧化氫酶活性為陽性。說明Tn5 的插入突變沒有引起LN2-M2716 的型變(Akhurst，1980)。

2.3 LN2-M2716 菌株對LN2 感染期線蟲恢復發(fā)育的影響

由圖2 可知，LN2 感染期線蟲置于野生型與突變菌株培養(yǎng)液的上清過濾液中培養(yǎng)1 d 后開始有少量線蟲恢復，培養(yǎng)6 d 后線蟲恢復率達到最高值，分別為52%和54%。突變菌株上清過濾液的LN2感染期線蟲在各時段的恢復率略高于野生型菌株，但除了第2 d 外，差異不明顯。結果表明，Tn5 的插入突變沒有影響LN2-M2716 誘導線蟲恢復發(fā)育的能力。

圖2 25°C 培養(yǎng)下H.indica LN2 感染期線蟲在P.luminescens LN2 與LN2-M2716 上清液培養(yǎng)的恢復率Fig.2 Infective juvenile recovery of H.indica LN2 recorded after exposure to culture supernatants of P.luminescens LN2 and LN2-M2716 at 25℃

2.4 LN2-M2716 對H.indica LN2 線蟲生長的影響

無菌LN2 感染期線蟲與不同菌株共培養(yǎng)32 h、68 h、122 h、8 d、12 d 后的生長發(fā)育情況見圖3。與細菌共培養(yǎng)32 h 后，100%的LN2 線蟲已恢復并長至J4，在恢復率上野生型和突變菌株之間沒有顯著差異。共培養(yǎng)68 h 后，全部LN2 線蟲發(fā)育至成蟲，但在LN2-W 菌株中只有10%的線蟲懷卵，而在LN2-M2716 菌株中90% 以上的線蟲懷卵，顯著高于LN2-W。共培養(yǎng)122 h 后，在LN2-W中，94%的LN2 線蟲發(fā)育至懷卵成蟲;而在LN2-M2716 中，100%線蟲已出現(xiàn)下一代幼蟲。共培養(yǎng)8 d 后，當LN2-W 中100%的線蟲已發(fā)育至懷蟲階段時，在LN2-M2716 中已可見大量的第二代幼蟲從母體爬出。共培養(yǎng)12 d 后，兩種菌株中均已出現(xiàn)第二代線蟲，但各齡期線蟲的比例不同。在LN2-W 中，近70% J1-J2，約27% IJ，3%J4，未見成蟲;在LN2-M2716 中，約18%為J1-J2 齡期，71% IJ，10% J4，0.5%為成蟲。培養(yǎng)12 d 后，野生型LN2-W 和突變菌株LN2-M2716的LN2 感染期線蟲產(chǎn)量分別為59.8 條/孔和220.4條/孔(圖4)。

以上結果表明，突變菌株LN2-M2716 可顯著加快線蟲的生長發(fā)育。

2.5 LN2-M2716 對H.bacteriophora H06 線蟲的毒性

LN2 共生細菌對H06 線蟲有種間特異的殺線蟲作用(Han and Ehlers，1998，1999，2001)。培養(yǎng)2 d、4 d、6 d 后，突變菌株LN2-M2716 中H06 感染期線蟲的存活率分別為40%、15%、4%，顯著低于野生型菌株LN2-W 中的線蟲存活率(分別為63%、39%、18%)。結果表明，LN2-M2716 對H06 線蟲的致死活性顯著高于野生型。

圖3 LB 平板中H.indica LN2 線蟲在P.luminescens LN2 和LN2-M2716 菌株中的生長發(fā)育情況Fig.3 Nematode development of H.indica LN2 on P.luminescens LN2 and LN2-M2716 growing on LB agar

圖4 LB 平板中H.indica LN2 線蟲在P.luminescens LN2和LN2-M2716 菌株中培養(yǎng)12 d 后的第二代線蟲數(shù)量Fig.4 Number of the next generation nematode of H.indica LN2 after 12 days' growth on P.luminescens LN2 and LN2-M2716 growing on LB agar

表2 H.bacteriophora H06 線蟲于野生型和突變菌株中的存活率Table 2 The survival rates of H.bacteriophora H06 IJs in wild-type and mutant cultures

2.7 LN2-M2716 對大蠟螟的注射毒力

當注射的細菌濃度為1000 和2000 CFU/μL，24 h 后野生型菌株LN2-W 和突變株LN2-M2716均引起大蠟螟100% 死亡;而注射的細菌濃度為100 與200 CFU/μL、10 與20 CFU/μL 時，則分別在30 h、36 h 后引起100%的大蠟螟死亡率。注射PBS 的對照組中，直至12 d 仍未有大蠟螟死亡。結果表明，野生型菌株LN2-W 與LN2-M2716對大蠟螟注射毒力無顯著差異。

2.8 LN2-M2716 對H.indica LN2 固體培養(yǎng)產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)8 d、16 d、21 d、26 d 和31 d 時，以突變菌株LN2-M2716 培養(yǎng)的LN2 感染期線蟲產(chǎn)量均顯著高于以野生型菌株LN2-W 培養(yǎng)的(圖5)。培養(yǎng)26 d 時，以兩個菌株培養(yǎng)的感染期線蟲產(chǎn)量均達到最大值，野生型菌株與突變菌株的線蟲產(chǎn)量分別為每克海綿培養(yǎng)基3.5×105IJs 和5.2×105IJs。結果表明，突變株LN2-M2716 顯著提高了LN2 感染期線蟲的固體培養(yǎng)產(chǎn)量。

圖5 LN2-M2716 及野生型LN2-W 菌株中H.indica LN2 線蟲的固體培養(yǎng)產(chǎn)量Fig.5 Yields of H.indica LN2 IJs harvested from the solid culture with mutant LN2-M2716 and wild type LN2

3 結論與討論

昆蟲病原線蟲與共生細菌之間的共生關系主要表現(xiàn)在食物信號、營養(yǎng)、攜菌作用、種間特異的殺線蟲作用等方面的?；?Han and Ehlers，1998，2001;Ciche and Ensign，2003;Martens and Goodrich-Blair，2005;丘雪紅等，2010)。本文利用Tn5 轉座突變方法構建P.luminescens LN2 細菌的突變體庫，篩選影響線蟲與細菌共生?；缘耐蛔兙?，獲得的突變菌株LN2-M2716 既能促進H.indica LN2 的生長、發(fā)育以及感染期線蟲產(chǎn)量，又可增強對H.bacteriophora H06 線蟲的致死毒性。

這是通過轉座突變首次獲得可提升感染期線蟲產(chǎn)量的突變菌株，對這類生物殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化和應用意義重大。

在這類線蟲的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)時間和產(chǎn)量顯著影響昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化成本。在感染期線蟲恢復發(fā)育過程中，共生細菌產(chǎn)生的食物信號的誘導是關鍵一步 (Strauch and Ehlers，1998;Han and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)。LN2-M2716 突變菌株對感染期線蟲恢復發(fā)育無影響。但LN2-M2716 顯著促進線蟲的生長發(fā)育速度并支持高產(chǎn)量的感染期線蟲產(chǎn)量，表明Tn5 的插入改變LN2-M2716 的代謝，提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)適合性。本文結果為研究共生細菌對昆蟲病原線蟲的營養(yǎng)作用提供良好的實驗材料，為昆蟲病原線蟲的低成本產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)及高效應用提供了有用的菌株，將推動線蟲的推廣應用。

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