白 璐 王建瓊 蔣宏君 付 輝 王 凡 朱 磊

云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650034

活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原(Fib)統(tǒng)稱為凝血四項(xiàng)，是目前臨床上用于診斷和觀察血栓形成、抗凝治療的常用檢測項(xiàng)目，可作為反映機(jī)體內(nèi)外凝血機(jī)制功能異常的篩選實(shí)驗(yàn)，在出血性/血栓性疾病診斷、手術(shù)前準(zhǔn)備、抗凝治療監(jiān)測等有重要作用，準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果對臨床診斷和治療非常重要，但影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多，該研究從標(biāo)本的離心時間和放置時間對凝血篩選檢測的影響進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑STA-R Evolution 全自動血凝分析儀及配套試劑（法國Stago）、109 mmol/L 枸櫞酸鈉真空抗凝管（武漢致遠(yuǎn)）、TDZ4A-WS 低速臺式離心機(jī)（長沙湘儀）。

1.1.2 標(biāo)本來自本院住院的無凝血功能異常史的普通患者50例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 用一次性枸櫞酸鈉1∶9

真空抗凝管平行采集3 組各50 例血液標(biāo)本，以定量3 mL 至指定刻度，立即顛倒混勻，于3 000 r/min 速度下經(jīng)5 min、8 min、10 min 3 種不同時間離心后,在相同條件下測定APTT、PT、TT、Fib 結(jié)果。離心10 min 組為對照組。所有標(biāo)本抗凝比例準(zhǔn)確、無溶血、無采血不暢及凝固標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本放置時間的影響 用一次性枸櫞酸鈉1∶9 真空抗凝管平行采集4 組各50 例血液標(biāo)本，其中一組立即測定即為對照組，另外3 組分別于室溫條件下放置2 h、4 h 及6 h 后測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

標(biāo)本在3 000 r/min 離心速度經(jīng)5 min、8 min、10 min 不同時間離心后，檢測APTT、PT、TT、Fib。結(jié)果顯示，以標(biāo)本離心10 min作為對照組相比，標(biāo)本離心5 min 時APTT、PT 明顯縮短，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而TT、Fib 結(jié)果與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)離心時間為8 min 時，四項(xiàng)檢測結(jié)果均與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1、表2。

表1 標(biāo)本離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

表1 標(biāo)本離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項(xiàng)目離心時間10 min5 min t 值P 值A(chǔ)PTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)36.5±2.9 14.1±1.2 17.5±1.3 4.17±0.5 31.9±2.7 10.8±0.9 16.9±1.5 4.13±0.6 35.500 22.483 1.555-1.108 0.001*0.002*0.260 0.416

表2 標(biāo)本離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

表2 標(biāo)本離心時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

項(xiàng)目離心時間10 min5 min t 值P 值A(chǔ)PTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)36.5±2.9 14.1±1.2 17.5±1.3 4.17±0.5 36.1±3.2 13.8±1.1 17.3±1.7 4.15±0.8 2.774 1.250 0.693-2.029 0.109 0.338 0.560 0.180

2.2 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

檢測結(jié)果顯示，隨著標(biāo)本放置時間的延長，對凝血四項(xiàng)的檢測結(jié)果有一定的影響。APTT 和PT 測定結(jié)果放置4 h、6 h 后與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3～5。

表3 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

表3 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

項(xiàng)目放置時間即刻2 h t 值P 值A(chǔ)PTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 33.8±3.2 12.1±0.7 17.3±2.7 3.41±0.6 1.791-1.309 2.426-0.066 0.148 0.321 0.228 0.953

表4 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

表4 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項(xiàng)目放置時間即刻2 h t 值P 值A(chǔ)PTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 35.9±3.4 12.6±0.5 17.1±2.8 3.39±0.7-5.546-4.571-1.463 0.228 0.031*0.045*0.281 0.841

表5 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

表5 標(biāo)本放置時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項(xiàng)目放置時間即刻2 h t 值P 值A(chǔ)PTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 36.5±3.2 12.8±0.6 17.5±2.3 4.45±0.5-7.913-5.237-0.450-3.493 0.016*0.035*0.679 0.073

3 討論

在凝血篩選檢測過程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受多種因素影響，如受血者狀態(tài)、標(biāo)本采集量及采集過程是否順暢、抗凝比例、采集后放置時間與處理、儀器設(shè)備、檢測方法等多方面因素的影響[1]。因此有學(xué)者建議將凝血篩選檢測標(biāo)準(zhǔn)化，包括標(biāo)本采集、保存及處理、試劑、報告方法的方面[2]。

APTT 是反應(yīng)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子水平比較敏感的指標(biāo)及常用的篩選實(shí)驗(yàn)，是檢測普通肝素的首選指標(biāo)，對其實(shí)施準(zhǔn)確的測定一方面能獲得最佳抗凝療效，且無嚴(yán)重的出血風(fēng)險[3]。APTT 測定原理為在37 ℃的溫度條件下，以白陶土或鞣花酸激活Ⅻ和Ⅺ因子，以腦磷脂代替血小板第三因子（PF3），在Ca2+的參與下，觀察缺乏血小板的前提下血漿凝固所需要的時間。

PT 是反應(yīng)外源性凝血系統(tǒng)凝血因子是否異常的較為敏感及常用的篩選實(shí)驗(yàn)，是反應(yīng)血漿中凝血酶原及因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平的首選指標(biāo)，亦為口服抗凝劑檢測的首選指標(biāo)。PT 測定原理為：在受檢血漿中加入過量的組織凝血活酶及Ca2+，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，凝血酶能使Fib 轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，此時血漿凝固。所檢測到的血漿凝固所需時間即為PT,可用于外源凝血系統(tǒng)檢測。該實(shí)驗(yàn)需制備乏血小板血漿，因采用富含血小板的血漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將導(dǎo)致PT 假性縮短，影響檢測結(jié)果[4]。TT 主要是對血中循環(huán)抗凝物質(zhì)如肝素進(jìn)行篩查，TT 的檢測原理是加入“標(biāo)準(zhǔn)化”凝血酶后血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，至凝塊形成所需的時間。Fib常用于纖溶的篩查[5]。

《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[6]對凝血四項(xiàng)標(biāo)本前處理的要求為3 000 r/min 離心10 min 后分離血漿標(biāo)本。因此本實(shí)驗(yàn)以標(biāo)本離心10 min 作為對照組。枸櫞酸鈉是鈣離子的快速螯合劑，對凝血因子Ⅴ、Ⅷ有保護(hù)作用，因此使用109 mmol/L 的枸櫞酸鈉作為抗凝劑，但是抗凝劑過多或過少都會影響檢測結(jié)果，因此必須保證血液標(biāo)本與109 mmol/L 枸櫞酸鈉的比例為9∶1 抗凝。

血小板在機(jī)體凝血過程中發(fā)揮重要作用。活化的血小板提供的PF3 是機(jī)體凝血過程的重要組成部分，提供了凝血的催化表面。體外檢測APTT 即是用腦磷脂代替血小板提供催化表面。用富含血小板的血漿檢測時，其凝血的磷脂催化表面增加，血小板表面吸附多種凝血因子，包括纖維蛋白原、凝血酶原、FⅦ、FⅨ、FⅩ。此外，血小板還有內(nèi)源性凝血因子。如FⅤ、FⅧ/VWF、FⅪ、FⅫ。這些凝血因子在某些情況下被釋放，故血漿中相應(yīng)凝血因子濃度升高，進(jìn)而出現(xiàn)APTT、PT 檢測時間縮短，尤其是APTT的縮短比PT 更為明顯。APTT 的檢測是反應(yīng)內(nèi)源性凝血途徑的功能，而PT 是檢測外源性凝血途徑的功能，血小板提供的PF3參與內(nèi)源性凝血途徑，形成復(fù)合FⅨ-FⅧa-Ca-PF3，并且具有對FⅩ活化、使凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶。活化因子Ⅹ在血小板膜上結(jié)合能夠使凝血反應(yīng)加速，其催化凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶的能力比未結(jié)合活化因子Ⅹ快300 000 倍。此外血小板還對FⅧ具有濃縮作用，能夠促進(jìn)FⅨ的活化。

采集后的標(biāo)本必須經(jīng)過離心處理主要目的就是為了獲得乏血小板血漿。因此離心速度和時間的不同將會導(dǎo)致凝血結(jié)果改變。如果離心時間較短，就不可能使標(biāo)本達(dá)到乏血小板血漿的水平，影響檢測結(jié)果。因此如果能在保障檢測質(zhì)量的同時縮短離心時間，工作速度將得到很大的提高。檢測結(jié)果顯示：以3 000 r/min 速度離心10 min 作為對照，標(biāo)本離心5 min 時APTT、PT 縮短，與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而TT、Fib 結(jié)果與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)離心時間為8 min 時，四項(xiàng)檢測結(jié)果均與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此可建議將凝血檢測標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)本前處理要求改為3 000 r/min 離心8 min 以提高檢測效率。

血液離體后即開始發(fā)生變化，并隨著存放時間和方式的不同，凝血因子會逐漸消耗而使檢驗(yàn)結(jié)果改變。從表2 中可以看出，2 h 標(biāo)本測定結(jié)果與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而APTT、PT 測定結(jié)果在4 h、6 h 與對照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TT 和Fib 測定結(jié)果均無差異。所以，經(jīng)離心分離后的凝血標(biāo)本在室溫條件下保存時，APTT、PT 測定應(yīng)在2 h 內(nèi)完成，否則會因凝血因子失活而造成測定結(jié)果延長。由于Ⅱ、Ⅹ因子活性在室溫下幾乎無變化，故TT 在標(biāo)本放置后變化很小[7]。

凝血篩選檢測的影響因素很多，人員素質(zhì)、儀器設(shè)備都不可忽視。盡可能選用配套試劑，作好標(biāo)本前處理，所有標(biāo)本都須要在室內(nèi)質(zhì)控在控的前提下進(jìn)行[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)溶血時PT、APTT均會顯著降低，TT 會顯著升高，而Fib 卻無明顯變化。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是：紅細(xì)胞表面磷脂具有凝血活酶的活性，從而改變了血漿的凝血時間[9]。

因此，凝血四項(xiàng)標(biāo)本的規(guī)范操作和正確采集是凝血檢測結(jié)果準(zhǔn)確的保證。樣本的正確采集是分析前質(zhì)量保障的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為避免檢測結(jié)果與臨床診斷不符的情況出現(xiàn)，造成不必要的抽血復(fù)查，增加患者的負(fù)擔(dān)及醫(yī)療資源的浪費(fèi)，建議在進(jìn)行標(biāo)本采集時，采集者需加強(qiáng)責(zé)任心，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度采集、處理標(biāo)本，最大限度減少誤差。操作人員的水平?jīng)Q定檢測系統(tǒng)能否輸出準(zhǔn)確結(jié)果，故加強(qiáng)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素養(yǎng)，不斷提高其理論水平及專業(yè)操作技能是必不可少的。

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