劉澤軍等

摘 要：為了解決庫爾勒香梨葉片營養(yǎng)診斷中“鐵素黃化悖論”問題，測定了庫爾勒香梨正常綠葉和失綠黃化葉片的全鐵、有效鐵和質(zhì)外體鐵的含量，并在此基礎(chǔ)上對全鐵和有效鐵的表征方法進行了研究。結(jié)果表明：香梨葉片產(chǎn)生缺鐵黃化的直接原因是缺乏有效鐵；缺鐵黃化的葉片有時全鐵含量相比于正常綠葉并不低；以葉面積為底數(shù)來表征香梨葉片鐵含量，可以消除“黃化悖論”迷局；香梨葉片中鐵的空間分布特征是質(zhì)外體中占58%～64%。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨；葉片；全鐵；有效鐵；質(zhì)外體鐵

中圖分類號：S661.2 文獻標(biāo)識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.003

Abstract：In order to solve the problem of "iron chlororsis paradox" in leaf nutrition diagnosis of Kuerle fragrant pear， the content of total iron，active iron and apoplastic iron in healthy leaf and chlorotic leaf of fragrant pear were measured. On this basis， the research method of characteristic of total iron and active iron was studied. The results showed that active iron deficiency was precipitating cause of iron chlorosis； the content of total iron in chlorotic leaf was no less than the healthy leaf； iron content indicated by specific leaf weight per area could eliminate the puzzle of "chlorosis paradox"； apoplastic iron accounted for more than 58%～64% of the total iron content in fragrant pear leaf.

Key words： Kuerle fragrant pear； leaf； total iron； active iron； apoplastic iron

在石灰質(zhì)土壤中，缺鐵失綠癥是一種常見的植物缺素病。庫爾勒香梨（以下簡稱香梨）作為新疆地區(qū)特有品種，在生產(chǎn)上因缺鐵造成的香梨果實變小，果實口味變差，大量減產(chǎn)甚至樹體死亡等問題一直困擾著當(dāng)?shù)毓r(nóng)[1]。在花器官診斷和光譜分析等營養(yǎng)診斷技術(shù)還不成熟的條件下，用葉片診斷來指導(dǎo)果園施肥是一種常規(guī)有效手段[2-7]。許多年來，庫爾勒香梨的缺鐵診斷也和其他果樹一樣，采用單位葉干質(zhì)量全鐵含量這一指標(biāo)來評價香梨樹體鐵營養(yǎng)狀況。但是，在測定葉片全鐵含量時，常常會遇到失綠黃化葉片的全鐵含量與正常綠葉的全鐵含量相差不多甚至比其高的現(xiàn)象，稱之為“Iron Chlorosis Paradox（鐵素黃化悖論）”[8-11]。因此，全鐵含量不僅不能判斷果樹鐵營養(yǎng)狀況，還會給科研人員帶來困擾。董慕新[12]對果樹葉片有效鐵進行了較為深入的研究，本研究在借鑒其結(jié)論的基礎(chǔ)上，對庫爾勒香梨葉片有效鐵進行了測定。從結(jié)構(gòu)角度來說：質(zhì)外體是細(xì)胞膜以外，由細(xì)胞壁的纖維微晶空間及充滿水分和空氣的細(xì)胞間隙構(gòu)成的空間。質(zhì)外體在植物根、莖、葉等各個器官中均存在，在地上部呈連續(xù)體。從功能角度來說：質(zhì)外體是植物進行養(yǎng)分吸收與運輸，物質(zhì)積累與轉(zhuǎn)化，及微生物反應(yīng)的空間，但關(guān)于葉片從質(zhì)外體中獲取礦質(zhì)營養(yǎng)特別是鐵的研究還較少[13]。筆者探索了庫爾勒香梨葉片中鐵可利用的主要形態(tài)和空間分布情況，在摸清葉片中鐵的可利用形態(tài)和“鐵庫”位置的基礎(chǔ)上，解除“鐵素黃化悖論”給人們帶來的困擾，以期在生產(chǎn)上為庫爾勒香梨缺鐵矯正做到有的放矢，提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

參照黎秀麗[14]的失綠黃化分級標(biāo)準(zhǔn)，2010—2013年從庫爾勒地區(qū)英下鄉(xiāng)、托布力其鄉(xiāng)、沙依東園藝場、農(nóng)科所等地，對供試的3級失綠黃化香梨樹的上、中、下不同方向枝條上隨機采取當(dāng)年生新梢中部有代表性的2級失綠黃化程度葉片300片。在0級正常樹上的上、中、下部枝條上隨機取0級正常綠葉為對照樣。

新鮮葉樣的預(yù)處理：所采新鮮葉樣應(yīng)立即裝入留有小孔的透明塑料袋中，放入盛有冰袋的泡沫保溫箱中，24 h內(nèi)帶回實驗室，用于含水量、葉面積和質(zhì)外體鐵含量的測定。

干燥葉樣的預(yù)處理：所采葉樣先用0.1%無離子洗滌劑溶液洗滌，然后用自來水沖洗兩遍，最后用去離子水洗凈，風(fēng)干葉表水。置于透氣性較好的紙袋里，放入鼓風(fēng)干燥箱中。在105 ℃下殺青30 min，75 ℃鼓風(fēng)干燥48 h至恒質(zhì)量。干燥后的葉樣用瓷研缽磨碎后，過0.4 mm孔徑的篩，裝于塑料瓶中待測。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 全鐵的測定 準(zhǔn)確稱取2.0 g磨碎處理后的樣品3份，分別置于30 mL瓷坩堝中，放到盤式電爐焙燒炭化。稍涼后放入600 ℃馬弗爐內(nèi)灰化4 h，待涼后加入10 mL5%HNO3溶解，過濾至100 mL容量瓶中，適量熱蒸餾水洗滌坩堝，KSCN檢驗有無殘余鐵，蒸餾水定容至100 mL。吸取20 mL樣液放入對應(yīng)50 mL容量瓶，加入4 mL10%鹽酸羥氨，充分搖勻后靜置5 min，再加入5 mL10%醋酸鈉，2 mL0.1%鄰菲啰啉顯色，靜置30 min后在530 nm處測其吸光度，并計算鐵含量[15-16]。

1.2.2 有效鐵的測定 稱取1.0 g磨碎處理后的葉樣3份分別置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1鹽酸定容至50 mL，加蓋靜置浸提24 h后，分別過濾至50 mL潔凈容量瓶中，吸取5 mL浸提液，加蒸餾水至20 mL，以后步驟同全鐵含量測定。

1.2.3 香梨葉片質(zhì)外體汁液中鐵含量測定 先進行香梨葉片質(zhì)外體汁液的提取。質(zhì)外體汁液提取按文獻[17-22]的方法進行。將新鮮葉片用去離子水洗凈、擦干，稱取葉片質(zhì)量后，在負(fù)1個大氣壓的真空下向葉片滲入預(yù)冷的濃度為0.28 mmol·L-1山梨醇溶液，直到葉片顏色變深，表面有大量小氣泡時為止，時間為5 min。然后取出葉片，吸干表面水分，將葉片放入特制離取裝置中5 000×g（失綠黃化葉按4 000×g）速率離心10 min，離心溫度控制在4 ℃以下。所收集的液體即為香梨葉片質(zhì)外體汁液。

質(zhì)外體汁液中鐵含量測定的步驟為：先對離取的質(zhì)外體汁液稱質(zhì)量，同時取相同質(zhì)量的去離子水做空白對照，倒入100 mL錐形瓶中，加入30 mL濃高氯酸（分析純）和濃硝酸（分析純）（5∶1）混合酸置于盤形電爐上消煮，當(dāng)液體透明時即可停止消煮。向消煮液錐形瓶內(nèi)加20 mL蒸餾水，過濾至100 mL容量瓶中，再用10 g·L-1熱鹽酸洗滌錐形瓶內(nèi)殘渣，用50 g·L-1熱鹽酸洗凈錐形瓶內(nèi)3價鐵（KSCN檢驗），溫蒸餾水洗滌數(shù)次，定容至100 mL。吸取20 mL樣液，其余步驟同全鐵的測定[23]。

1.2.4 葉片含水量的測定 取采回的香梨正常和黃化葉片處理的鮮葉樣20片，稱量鮮質(zhì)量（初試鮮質(zhì)量），經(jīng)105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，計算葉片含水量[24]。

葉片含水量=[（初始鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/初始鮮質(zhì)量]×100%

1.2.5 葉面積的測定 用紙質(zhì)量法測香梨葉片葉面積，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表征方法表征香梨葉片全鐵和有效鐵含量的比較

“鐵素黃化悖論”現(xiàn)象是在測算葉片全鐵含量時發(fā)現(xiàn)的，由圖1可知，在4個采樣點，用單位葉干質(zhì)量表征全鐵含量時，沙依東和州農(nóng)科所所采不同處理葉片全鐵含量差異不顯著，4組數(shù)據(jù)的平均值差異也不顯著，這就出現(xiàn)了“黃化悖論”現(xiàn)象；其余2個采樣點所采葉片全鐵含量差異均極顯著。用單位葉面積表征葉片全鐵含量時，4個采樣點正常綠葉和失綠黃葉葉片全鐵含量差異均極顯著。由圖2知，當(dāng)用單位葉干質(zhì)量表征葉片有效鐵含量時，還是有2個采樣點不同處理葉片鐵含量差異只是顯著；當(dāng)用單位葉面積表征葉片有效鐵含量時，4個點所采不同處理葉片有效鐵含量差異均極顯著。綜合4種表征方法來看，以單位葉面積為底數(shù)來表征全鐵和有效鐵含量可以避免出現(xiàn)“鐵素黃化悖論”現(xiàn)象，可以此計算方法，通過大量測定對比，提出庫爾勒香梨葉片鐵含量診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 香梨失綠黃葉和正常綠葉單位葉面積質(zhì)量和灰分率的比較

缺鐵對香梨生長的影響是多方面的，通過對香梨葉片單位葉面積質(zhì)量和灰分率分析，如表1所示，當(dāng)用單位葉面積質(zhì)量來區(qū)分缺鐵失綠葉片和正常綠葉時，二者差異很大，采樣試點及其均值的單位葉面積重量均呈極顯著差異，說明缺鐵嚴(yán)重影響了香梨葉片的正常擴展和干物質(zhì)積累。在灰分率對比中，失綠黃葉均值為11.41%，而正常綠葉是9.13%，兩者的差異亦極顯著。由于灰分元素是從土壤中吸收的，這種灰分率的極顯著差異表明黃化香梨葉片礦質(zhì)元素的積累和代謝紊亂，而傳統(tǒng)上以葉干質(zhì)量為底數(shù)來表征葉片鐵含量并不能表明這種差異[25]。

2.3 香梨黃化葉片和正常綠葉中質(zhì)外體鐵含量分析

由表2可知，在新鮮葉質(zhì)量基礎(chǔ)上表示質(zhì)外體中鐵的含量時，正常綠葉質(zhì)外體中鐵含量是29.85 mg·kg-1，約占全鐵含量的58%；黃化葉片質(zhì)外體中的鐵含量約占對應(yīng)全鐵含量的64%。因離取的質(zhì)外體汁液絕對量較少，加上未充分離取出的一部分，計算出的質(zhì)外體鐵含量會大于目前所得數(shù)值。如果以全鐵含量減去對應(yīng)的質(zhì)外體鐵含量就得到葉片能利用的鐵含量，這部分鐵數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于所對應(yīng)的有效鐵數(shù)量，表明質(zhì)外體中有一部分鐵可能是被還原的以2價態(tài)形式存在的。失綠黃葉中的質(zhì)外體鐵由于還原酶缺乏或者活力很弱無法還原足夠量鐵進入葉片生理代謝循環(huán)。失綠黃葉的含水量與正常綠葉比，方差檢驗差異性達到顯著水平，失綠黃葉由于生理性缺素導(dǎo)致葉片營養(yǎng)器官功能降低，損耗了較多營養(yǎng)物質(zhì)，無法積累到正常水平的干物質(zhì)量供樹體其余器官代謝，也導(dǎo)致了葉片含水量所占比例升高。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)筆者的試驗分析，庫爾勒香梨葉片表觀黃化，以常規(guī)方法測全鐵的量與正常綠葉比差異并不顯著，有時甚至比正常綠葉全鐵含量還高，表明這種缺鐵并不是真正的缺乏鐵元素，而是一種生理性缺鐵。香梨葉片在鐵絕對含量并不缺少的情況下，卻表現(xiàn)出缺鐵黃化癥狀，表明葉片中的鐵有一部分以不可利用的方式被貯存。有效鐵，又叫生理活性鐵，常用0.1 mol·L-1鹽酸浸提鐵來定義 [26-28]。在本研究中，香梨黃化葉片的有效鐵含量顯著小于正常綠葉，以前筆者的試驗和大量文獻中也驗證了有效鐵含量和對應(yīng)葉片的葉綠素含量的高度相關(guān)性[14]。但為何失活鐵沒被轉(zhuǎn)化為有效鐵，0.1 mol·L-1鹽酸浸提的鐵是不是全部有效鐵，目前仍處在假說階段，尚無統(tǒng)一的說法。筆者對香梨葉片質(zhì)外體中鐵的含量測定表明，無論是正常綠葉還是黃化葉片，很大一部分是聚集在質(zhì)外體中。由于質(zhì)外體是細(xì)胞壁組成的連續(xù)體，這種連續(xù)體是在細(xì)胞膜外，所以質(zhì)外體鐵可以理解為是附著在細(xì)胞壁之上的，這部分質(zhì)外體鐵可以看作是葉片的“鐵庫”。在正常葉片中，質(zhì)外體鐵庫可以理解為為防止細(xì)胞內(nèi)鐵吸收過量而產(chǎn)生的一種解毒機制；在缺鐵狀態(tài)下，葉片中氫離子分泌增加還原力增強，質(zhì)外體中的鐵可以重新溶解被細(xì)胞吸收，從而抵抗短期缺鐵[27]。而對于黃化葉片，有一種假說認(rèn)為，土壤或培養(yǎng)液中高濃度HCO3-環(huán)境或者大量硝態(tài)氮（NO3-）肥的施加，使得葉片質(zhì)外體中pH值升高，這種高pH值環(huán)境嚴(yán)重抑制了位于細(xì)胞質(zhì)膜上的3價鐵還原酶的活性，從而導(dǎo)致只有極少量的2價鐵穿過細(xì)胞質(zhì)膜進入到葉片共質(zhì)體內(nèi)被細(xì)胞利用，而使葉片缺鐵黃化[9]。這些不能被利用的高價鐵可能就會聚集在細(xì)胞質(zhì)膜外，附著在細(xì)胞壁上。這樣黃化葉片質(zhì)外體鐵含量就會升高，整個葉片鐵濃度就會增加，也就會產(chǎn)生黃化葉片全鐵含量有時比黃化葉片還要高的不可思議現(xiàn)象。

綜上筆者認(rèn)為，（1）庫爾勒香梨葉片產(chǎn)生缺鐵黃化的直接原因是缺乏有效鐵，有效鐵是葉片能利用的鐵的主要形態(tài)，以葉干質(zhì)量或葉面積為底數(shù)皆可以作為香梨鐵素營養(yǎng)的表征量。（2）有些缺鐵黃化的葉片全鐵含量相比于正常綠葉并不低，說明缺鐵黃化是一種生理性失調(diào)，以葉面積為底數(shù)的全鐵含量可以表征香梨鐵素營養(yǎng)狀況，以葉干質(zhì)量為底數(shù)雖然不能體現(xiàn)，但可以為矯正缺鐵黃化的物質(zhì)基礎(chǔ)做出判斷。（3）香梨葉片的鐵庫存在于質(zhì)外體中，也就是說香梨葉片中鐵的空間分布特征是質(zhì)外體中占58%～64%多，共質(zhì)體占一小部分，黃化葉片的質(zhì)外體中的鐵由于外部環(huán)境所致并沒有被葉細(xì)胞吸收利用。

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綜上筆者認(rèn)為，（1）庫爾勒香梨葉片產(chǎn)生缺鐵黃化的直接原因是缺乏有效鐵，有效鐵是葉片能利用的鐵的主要形態(tài)，以葉干質(zhì)量或葉面積為底數(shù)皆可以作為香梨鐵素營養(yǎng)的表征量。（2）有些缺鐵黃化的葉片全鐵含量相比于正常綠葉并不低，說明缺鐵黃化是一種生理性失調(diào)，以葉面積為底數(shù)的全鐵含量可以表征香梨鐵素營養(yǎng)狀況，以葉干質(zhì)量為底數(shù)雖然不能體現(xiàn)，但可以為矯正缺鐵黃化的物質(zhì)基礎(chǔ)做出判斷。（3）香梨葉片的鐵庫存在于質(zhì)外體中，也就是說香梨葉片中鐵的空間分布特征是質(zhì)外體中占58%～64%多，共質(zhì)體占一小部分，黃化葉片的質(zhì)外體中的鐵由于外部環(huán)境所致并沒有被葉細(xì)胞吸收利用。

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綜上筆者認(rèn)為，（1）庫爾勒香梨葉片產(chǎn)生缺鐵黃化的直接原因是缺乏有效鐵，有效鐵是葉片能利用的鐵的主要形態(tài)，以葉干質(zhì)量或葉面積為底數(shù)皆可以作為香梨鐵素營養(yǎng)的表征量。（2）有些缺鐵黃化的葉片全鐵含量相比于正常綠葉并不低，說明缺鐵黃化是一種生理性失調(diào)，以葉面積為底數(shù)的全鐵含量可以表征香梨鐵素營養(yǎng)狀況，以葉干質(zhì)量為底數(shù)雖然不能體現(xiàn)，但可以為矯正缺鐵黃化的物質(zhì)基礎(chǔ)做出判斷。（3）香梨葉片的鐵庫存在于質(zhì)外體中，也就是說香梨葉片中鐵的空間分布特征是質(zhì)外體中占58%～64%多，共質(zhì)體占一小部分，黃化葉片的質(zhì)外體中的鐵由于外部環(huán)境所致并沒有被葉細(xì)胞吸收利用。

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