章尤權(quán)，王清泰，魏建威，王素清，陳旭征，杜 建

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003；2.福州大學校醫(yī)院，福建 福州 350002；3.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122）

芪靈扶正清解顆粒是福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑（批號：閩藥制字Z20120004），主要在消化道腫瘤患者圍手術(shù)期和圍放化療期使用，在提高腫瘤患者免疫功能、減少放化療毒副反應、控制瘤體生長等方面療效顯著。前期的研究我們發(fā)現(xiàn)芪靈扶正清解顆粒能夠誘導絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亞族 P38磷酸化蛋白的表達從而誘導肝癌HepG2細胞發(fā)生凋亡［1］。本研究基于P38MAPK通路的上游關(guān)鍵因子ras，初步研究芪靈扶正清解顆粒對人HepG2肝癌細胞增殖的影響及對ras基因和蛋白表達的影響，為芪靈扶正清解顆?？鼓[瘤作用提供有力的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國 Hyclone Co.）；Trizol試劑（美國 Invitrogen Co.）；SYBR GreenⅠ熒光染料（美國 Applied Biosystems Co.）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；抗人ras抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Cycletest Plus DNA試劑盒（美國Becton Dickinson Co.）；7500型熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems Co.）；DM4000B型顯微鏡（德國 Leica Microsystems Co.）；150 型 CO2培養(yǎng)箱（德國 HERA-cell Co.）；FASCalibur型流式細胞儀（美國 Becton Dickinson Co.）。

1.2 細胞、藥材與實驗動物 人肝癌細胞株HepG2由福建省腫瘤醫(yī)院提供，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；芪靈扶正清解顆粒由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供；體重（200±20）g的雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2009-0005。所有動物被飼養(yǎng)在溫度和濕度相對恒定的環(huán)境下，實驗通過福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會認可。

1.3 實驗方法

1.3.1 含藥血清的制備 按照隨機數(shù)字表法則將大鼠隨機分為4組：高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白組，每組7只。根據(jù)大鼠與人體間等效劑量的換算原則，分別灌胃相當于成人臨床每日推薦劑量的 12 倍、6 倍和 3 倍的中藥顆粒， 即 5.4 g／（kg·d）、2.7 g／（kg·d）、1.35 g／（kg·d）劑量的中藥顆粒及等體積生理鹽水，連續(xù)灌服7 d，1 d 2次。末次灌胃1 h后腹主動脈取血，分離血清，0.22 μm抽濾除菌，56℃滅活，得到各組含藥血清和空白血清。用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶5稀釋得到20%的含藥血清和空白血清，作為干預細胞的劑量。

1.3.2 細胞周期檢測 HepG2細胞以1×105個／mL的密度接種在6孔板中，20%含藥血清和20%空白血清干預24 h后消化細胞，制備成細胞懸液。細胞周期檢測步驟嚴格按照Cycletest Plus DNA試劑盒的說明書操作，流式細胞儀檢測。CellQuest軟件獲取10000個細胞，ModFit軟件分析細胞各個期的百分含量，并計算增殖指數(shù)（proliferating index，PI）：

PI＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）×100%。

1.3.3 相對熒光定量PCR檢測k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平 20%空白血清和中劑量含藥血清作用細胞24 h后，收集細胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。k-ras、h-ras和 n-ras引物序列見表 1。20 μL PCR反應體系中分別加入SYBR GreenⅠMix，cDNA，上下游引物和 H2O。PCR擴增反應條件為：50℃2 min，95℃預變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火及延伸1 min，擴增40個循環(huán)，60℃延伸時采集熒光信號，熔解曲線考查引物特異性。Ras mRNA的基因表達量（RQ）用 2-△△Ct表示，其中 Ct表示擴增基因熒光強度達到一定閾值的循環(huán)數(shù)，參照文獻［2］。

用超純水代替cDNA模板進行擴增作為實驗的陰性對照。

表1 k-ras、h-ras、n-ras和 GAPDH引物序列

1.3.4 免疫細胞化學染色分析ras蛋白的表達 細胞爬片，置于冷丙酮固定20 min，10%羊血清封閉15 min，加入ras抗體，4℃過夜孵育，洗滌，加入二抗孵育2 h，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色，表達部位在細胞漿上。用PBS代替ras抗體作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，細胞周期結(jié)果采用單因素方差分析，ras基因結(jié)果采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 芪靈扶正清解顆粒對HepG2細胞增殖能力的影響，見圖1和表2。芪靈扶正清解顆粒含藥血清干預人HepG2細胞后，G0／G1期細胞的百分含量較空白組明顯升高，S期細胞的百分含量較空白組明顯減少，PI指數(shù)也明顯降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性?？梢娷戊`扶正清解顆粒能將肝癌細胞阻滯在G0／G1期，抑制DNA合成。

圖1 4組肝癌細胞株HepG2細胞周期典型圖

表2 4組間肝癌細胞株HepG2各個時期百分含量比較（±s）%

表2 4組間肝癌細胞株HepG2各個時期百分含量比較（±s）%

注：與空白組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與低劑量組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01；與中劑量組比較，5） P＜0.05，6） P＜0.01。

PI 39.20±1.4335.68±0.931）34.07±0.602）32.33±0.532）3）組 別空白組低劑量組中劑量組高劑量組G0／G160.74±1.3764.33±0.931）65.93±0.602）67.67±0.532）3）S 24.50±1.1323.97±0.4421.56±0.311）16.68±0.622）4）6）G2／M 14.69±0.4611.71±0.8612.51±0.4415.65±0.294）5）

2.2 芪靈扶正清解顆粒對ras基因家族成員k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平的影響 見圖2。芪靈扶正清解顆粒干預HepG2細胞24 h后，h-ras、k-ras和n-ras mRNA水平平均下降了 81.1%、43.3%和70.7%，統(tǒng)計結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01）?？梢娷戊`扶正清解顆粒能顯著下調(diào) k-ras、h-ras和 n-ras mRNA的表達。

圖2 空白組與中劑量組k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平比較

2.3 芪靈扶正清解顆粒對P21ras蛋白表達的影響，見圖3。P21ras表達陽性的細胞呈現(xiàn)棕黃色，表達部位在細胞漿上。經(jīng)中劑量含藥血清干預后可見P21ras陽性表達的細胞明顯減少，可見芪靈扶正清解顆粒能顯著下調(diào)P21ras蛋白的表達。

圖3 空白組與中劑量組P21ras蛋白水平比較

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計肝癌在我國惡性腫瘤死因中位列第二［3］。肝癌的臨床治療手段有限，結(jié)合中醫(yī)藥治療成為臨床肝癌防治的重要手段之一。芪靈扶正清解顆粒主要由黃芪、女貞子、靈芝、山藥、白花蛇舌草和夏枯草組成?，F(xiàn)代藥理學研究表明：這六味藥中含有多糖類、皂苷類、黃酮類、三萜類、蒽醌類、甾體類等多種成分，不僅能夠提高圍手術(shù)期和圍放化療期腫瘤患者的體液免疫和細胞免疫功能，還可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制增殖和血管新生［4-9］，是值得研究和開發(fā)的抗癌輔助用藥。

眾所周知，細胞周期的啟動、運行和終止的異常均可引起細胞失控性生長，從而導致腫瘤的發(fā)生。因此阻滯細胞周期的進程可有效抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡。本文應用流式細胞術(shù)首先調(diào)查了芪靈扶正清解顆粒含藥血清對人肝癌細胞株HepG2細胞周期的影響。研究發(fā)現(xiàn)芪靈扶正清解顆粒含藥血清干預人HepG2細胞后，G0／G1期細胞的百分含量明顯升高，S期細胞的百分含量明顯減少，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明芪靈扶正清解顆粒含藥血清能將人肝癌細胞株HepG2阻滯在G0／G1期，阻止損傷細胞進入S期進行DNA的合成，影響了G1／S轉(zhuǎn)換的進程，有效地抑制了HepG2的過度增殖。

為進一步探討芪靈扶正清解顆粒阻滯細胞周期的機制，我們調(diào)查了與G1／S轉(zhuǎn)換進程密切相關(guān)的ras基因和蛋白的表達。ras癌基因是人類腫瘤中最常見的癌基因，有三個家族成員，分別是h-ras、k-ras和n-ras［10］。當這些基因異常表達或突變時，可引起其編碼的ras蛋白的異常活化。ras蛋白是一種膜結(jié)合型的GTP／GDP結(jié)合蛋白，定位于細胞膜內(nèi)側(cè)，因其分子量為21千道爾頓，故又叫P21ras蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌的發(fā)生中，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的ras癌基因處于高度激活狀態(tài)，進而活化ras蛋白。持續(xù)活化的ras蛋白激活其下游的效應蛋白raf-1，使得MAPK的激酶MEK磷酸化而活化，進而磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶ERK、C-Jun N端激酶JUK／應激激活蛋白激酶SAPK和p38MAPK，激活下游底物 AP-1、ELK-1、SAP、C-Jun、C-fos和 c-myc， 參與細胞生長、發(fā)育、增殖、分化等多種生理過程，并在腫瘤惡變中起重要作用［11］。已證實ras基因和P21ras蛋白的異常表達均可導致原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展［12］。而ras抑制劑能夠誘導肝癌細胞的凋亡，降低ERK磷酸化水平，說明ras可作為原發(fā)性肝癌治療的潛在靶點［13］。有研究表明：ras參與了Cdk2和Cdk4的活化，進而調(diào)控Cdk2-cyclin-E2F信號轉(zhuǎn)導通路，從而影響細胞周期G1／S轉(zhuǎn)換的進程［14］。本研究發(fā)現(xiàn)：芪靈扶正清解顆粒顯著下調(diào)HepG2細胞k-ras、h-ras和n-ras mRNA和P21ras蛋白的表達水平。由此我們猜想，芪靈扶正清解顆粒抑制HepG2增殖可能的作用機制與其可以顯著抑制肝癌細胞ras基因和蛋白的表達，進而抑制Cdk2-cyclin-E2F信號轉(zhuǎn)導通路，影響G1／S轉(zhuǎn)換的進程有關(guān)。

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