祖琴琴，華萍，龔育清，楊安樹 *，陳紅兵

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.江西省食品工業(yè)研究所，江西 南昌 330029）

大豆含有蛋白質、異黃酮、低聚糖、皂苷及磷脂等營養(yǎng)因子，因此其具有增強體質和改善機體的抗病能力，還有降血壓，降低癌癥（包括腸和腎臟）、糖尿病和肥胖的發(fā)生率等許多重要的生理功能[1]。正因為如此，大豆及其制品深受廣大消費者青睞，其需求量也逐年上升。然而，大豆又是聯(lián)合國糧農組織（FAO）認定的八大類過敏食品之一[2]，其過敏反應90%都是由IgE介導而引發(fā)的[3]。據(jù)報道[4]大豆過敏患者約占食品過敏總人數(shù)的25%，而且多數(shù)為兒童，其中，大豆過敏兒童約占兒童過敏總人數(shù)的6%。迄今為止，大豆過敏尚無特效療法，應嚴格避免食用含大豆的食品是大豆過敏患者的最佳選擇，但不是最佳的方法。因此，為了減少大豆過敏的危害，利用食品加工方法開發(fā)低致敏或脫敏的大豆制品刻不容緩。

目前脫敏食物加工方法主要包括物理加工和生物加工，本文則重點介紹物理加工對大豆過敏原的影響。

1 大豆主要過敏原

目前已發(fā)現(xiàn)38種大豆過敏原，其中認為Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和β-伴豆球蛋白中的Gly m Bd 60K是大豆3種主要過敏原[5]。

Gly m Bd 30K，又稱P34，是一種由379個氨基酸殘基組成、分子質量為34u的單體，主要存在于7S蛋白中，約占大豆蛋白總含量的1%。目前發(fā)現(xiàn)，P34最少有5個表位能被過敏患者IgE所識別，分別位于氨基酸鏈中3～12、110～119、229～238、299～308和311～340處[6]，這些表位能被65%大豆過敏患者的血清所識別。因此，P34是大豆中致敏性最強的儲藏蛋白。

Gly m Bd 28 K，是一種由476個氨基酸殘基組成、分子質量為26u、等電點為6.1的糖蛋白，主要存在于7S蛋白中。其致敏性表位最主要體現(xiàn)在N-末端氨基酸序列：FHDDEGGDKKSPKSLFLMSSTR[7]，可被25%大豆過敏患者血清所識別，它與多糖的結合位點位于多肽鏈170位天冬酰胺處，該多糖由甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、木糖及海藻糖以3:2:1:1的比例組成，去糖基化作用后可使其致敏性完全消失。

Gly m Bd 60K被定義為β-伴豆球蛋白的α亞基，是一種由543個氨基酸殘基組成、分子質量為67u、等電點為4.9的糖蛋白，主要存在于7S蛋白中，含量約占β-伴豆球蛋白總量的45%。Gly m Bd 60K擁有15個線性表位，能與過敏患者血清結合的線性表位主要有 5個，分別位于氨基酸序列中 5～33、55～80、130～158、200～229和338～368處[4]，可被25%大豆過敏患者血清所識別。Gly m Bd 60K中的β-轉角和無規(guī)則卷曲易暴露在蛋白表面而與抗體結合，所以，其致敏性主要由β-轉角和無規(guī)則卷曲的含量所決定。

2 物理加工對過敏原的影響

迄今為止，物理加工廣泛應用于食品生產中，主要利用加熱、高壓、剪切力、輻照能等作用提高食品加工效率和降低食品中的有害因子。通過物理加工生產低致敏食品已受到國內外食品企業(yè)的高度關注，其優(yōu)勢在于可以避免或者減少化學或生物學方法對食品造成的污染，防止營養(yǎng)成分嚴重破壞和克服傳統(tǒng)加工耗時、投資成本高等缺陷。常見的物理加工過敏原的方法主要包括熱加工、輻照、高壓、高壓脈沖電場和超聲波等。

2.1 熱加工

熱加工是最常見的食品加工方法之一，其對食品致敏性會產生影響，研究表明[8]：加熱能使蛋白質在一些共價或非共價作用下形成分子內或分子間聚合物，這些聚合物在一定程度上掩蓋了過敏原的表位，進而影響蛋白質的致敏性。

抗原表位包括線性表位和構象表位，線性表位比構象表位穩(wěn)定，加熱主要通過改變蛋白質的二級和三級結構，使其構象表位發(fā)生改變，從而影響其致敏性[9]。Wilson[10]等研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白煮沸5min后P34的致敏性增強，而持續(xù)煮沸60min后致敏性則會減弱，這是因為P34在煮沸過程中抗原表位先暴露后又被掩蓋，光譜學表征是二級結構中α-螺旋含量發(fā)生變化。另有報道[11]，P34在加熱溫度為121.1℃時，蛋白結構會重新折疊，暴露出更多的過敏原表位，并與抗體結合，導致其致敏性增強。Bueks[12]等發(fā)現(xiàn)在80℃時7S和11S蛋白組分的致敏性會降低，而在100℃時又恢復到正常水平。另外，通過不同加熱方式處理豆類時，發(fā)現(xiàn)降低致敏性的效果與豆類的品種及含水量有關，如擠壓、烘烤、高壓蒸汽和微波處理扇羽豆后，結果表明僅有高壓蒸汽可以顯著地降低扇羽豆的致敏性[13]。

另有一些報道[14]發(fā)現(xiàn)熱加工在降低大豆致敏性效果方面并不理想，這是因為加熱僅會使大豆蛋白中的巰基和二硫鍵發(fā)生相互轉變，該轉變作用只對Kunitz胰蛋白酶抑制劑等產生作用，而大豆中多數(shù)過敏原如P34等表位結構比較穩(wěn)定，受熱加工的影響較小，所以單一的熱加工難以達到降低致敏性的效果。另外，熱加工還可能帶來食品安全隱患，嚴重時甚至會產生致癌物質[15]。

2.2 輻照

輻照的作用機理是當射線與食品接觸后，將其部分能量傳遞給食品中的分子和原子，使原子變成離子，離子再通過電離輻射在食品中產生物理、化學和生物學效應，以達到食品加工預期的要求和目的[16]。人們對輻照食品有所顧慮，通常認為人體攝入輻照劑量不超過10kGy的食品是安全的[17]。

輻照能顯著的降低食品的致敏性，這是因為輻照能使生物大分子降解、交聯(lián)和分子構象發(fā)生變化。輻照產生的能量促使蛋白質從原來有序的緊密卷曲結構向無序的松散結構轉變，使分子內部的疏水基團暴露在分子表面，掩蓋過敏原表位，降低了食品的致敏性[18]。另外，顧可飛[19]認為輻照降低食品致敏性主要通過兩種途徑，包括:（1）破壞B細胞或T細胞抗原表位的結構；（2）輻照導致生物大分子交聯(lián)作用，使抗原表位被屏蔽。

Shawrang[20]等研究表明：經(jīng)γ輻照處理后的β-伴豆球蛋白α，和α亞基在瘤胃中消化降解的時間延長，而β亞基沒有變化，同時發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白的酸性亞基發(fā)生降解，而堿性亞基沒有明顯變化，這是因為輻照處理使堿性亞基表面更加緊密且含有更多的疏水區(qū)域，難以與消化酶接觸而發(fā)生降解[21]。利用輻照降低食品致敏性時，水分含量起著重要作用，如γ輻射對干大豆中Kunitz胰蛋白酶抑制劑活性影響不大，當大豆中含有一定量水分時，即使輻射劑量很低也可使Kunitz胰蛋白酶抑制劑活性喪失，從而降低甚至完全消除Kunitz胰蛋白酶抑制劑的致敏性[22]。Kasera[23]等將加熱結合γ輻射來處理四季豆、黑綠豆和花生，這三種豆類在體內誘導產生的IgE的量分別減少了89%、87%和73%，而單獨使用γ輻射處理的豆類，致敏性并沒有明顯變化。另外，降低大豆蛋白的致敏性還可通過輻射處理獲得缺失過敏原的突變體來實現(xiàn)，如，日本科學家[24]通過γ輻射處理獲得了大豆的突變體即Tohoku124，該突變體缺失Gly m Bd 28K以及β-伴豆球蛋白的α，和α亞基。印度科學家[25]通過輻照處理獲得了缺乏大豆球蛋白A3亞基和β-伴豆球蛋白的α，和α亞基的大豆植株。

輻照改變蛋白的構象主要取決于輻照劑量、樣品水分含量及蛋白濃度。輻照可促使過敏蛋白的一級、二級和三級結構發(fā)生變化，使抗原表位被掩蓋或丟失，且該種變化是不可逆的，因此，在輻照加工過程中，通過工藝控制可有效的降低過敏食品的致敏性。

2.3 高壓

高壓處理是指在室溫或加熱條件下將食品放入液體介質中，利用100～1,000MPa的壓力作用一段時間使食品中相關成分的理化性質發(fā)生變化。高壓主要通過改變過敏原蛋白的三級和四級結構來影響其致敏性[26]。壓力強度的改變對過敏蛋白致敏性的影響不同。研究顯示[27]，在200～300MPa高壓時，蛋白分子內部的二硫鍵遭到破壞，導致天然蛋白結構展開，同時游離的巰基含量增加，疏水基團暴露在分子表面從而掩蓋過敏原表位，使大豆蛋白的致敏性降低；當壓力達到300MPa時，大豆的致敏性降低了48.6%；但壓力超過300MPa時，蛋白分子中二硫鍵又會重新締合，游離的巰基含量和疏水性會逐漸減少，致敏性則會有所增強。有文獻報道[28]：將高壓和酶解相繼作用于大豆乳清時，可以顯著地降低過敏原Gly m 1的致敏性，且比單一處理效果更好。Pe? as[29]等在300Mpa高壓下處理大豆15min后再進行發(fā)芽，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓處理比未高壓處理的大豆芽的致敏性明顯降低，這可能是由于高壓處理促進大豆在發(fā)芽的過程中，釋放出更多的內源蛋白酶，使得過敏蛋白的水解更徹底。

眾多研究結果表明，高壓被認為是降低大豆致敏性最有效的方法之一。高壓加工改變大豆蛋白致敏性受壓力強度、時間、大豆前處理等條件的影響。在一定的低壓范圍內，過敏原表位被掩蓋，導致其抗原的致敏性降低；超過這一低壓范圍，過敏原表位會再次暴露，致敏性則會輕微的增強；但是壓力超過某一極限值以后，過敏蛋白的一級和二級結構發(fā)生變化，且是不可逆的。

2.4 高壓脈沖電場

高壓脈沖電場（PEF）是以高電壓、短脈沖及溫和的溫度條件處理液態(tài)或半固態(tài)食品，由于脈沖處理時間短，熱能消耗少且?guī)缀醪划a生熱量，是一種新型的綠色加工技術[30]。利用PEF可改變大豆蛋白的分子結構。已有文獻報道：在PEF處理大豆分離蛋白過程中，隨著電場強度的增加和處理時間的延長，蛋白表面的游離巰基、疏水性及溶解度都會發(fā)生改變，說明PEF對大豆分離蛋白的二硫鍵和疏水作用有一定的影響；同時，發(fā)現(xiàn)PEF對大豆分離蛋白的二級結構影響并不顯著[31]。但也有報道稱[32]PEF會使大豆分離蛋白中β-折疊和不規(guī)則卷曲的含量增加。而中國科學家[4]就曾發(fā)現(xiàn)Gly m Bd 60K的致敏性主要是由β-折疊和不規(guī)則卷曲的含量決定的。PEF可以作用于7S和11S蛋白的表面極性氨基酸，使7S的α和α，亞基的末端氨基酸斷裂，同時極化了表面非極性氨基酸，從而破壞了空間結構連接鍵，導致蛋白質中亞基組成發(fā)生變化[33]。上述研究表明：PEF顯示出調控過敏原致敏性表位的潛在價值。Robert[34]認為高壓脈沖電場作用于蛋白溶液時會瞬間釋放一定的能量來改變蛋白分子間的自由焓，使氫鍵和范德華力發(fā)生變化，進而改變分子間的靜電作用和疏水作用，從而可能對過敏原的致敏性產生影響。另有研究顯示[35]，PEF可以顯著地增強乳清蛋白與葡聚糖的糖基化交聯(lián)反應，形成的聚合物可能會在一定程度上掩蓋過敏蛋白的表位。

目前關于高壓脈沖電場對食品致敏性的影響鮮有研究，國外關于高壓脈沖電場的研究才剛剛起步。相信，未來一段時期，高壓脈沖電場將在大豆及其制品的脫敏應用中具有廣闊的前景。

2.5 超聲波

超聲波瞬間產生的空化作用使能量高度聚集，能量在崩潰瞬間會產生高溫、高壓等一系列極端的物理效應，從而改變蛋白質的空間結構[36]。

超聲波處理促使Kunitz胰蛋白酶抑制劑分子中二硫鍵斷裂，巰基和 β-折疊含量明顯增加，而β-轉角和不規(guī)則卷曲含量則會降低，從而引起二級結構發(fā)生變化[37]。而Arzeni[38]研究顯示：當大豆蛋白經(jīng)超聲波處理后，巰基含量并沒有發(fā)生變化，但表面疏水性卻顯著提高。超聲處理常作輔助手段結合其他方法加工處理大豆蛋白。如 Lin[39]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波可以顯著改善大豆分離蛋白中一些亞基(α-7S和 A-11S)與水解酶接觸的難易程度；高強度的超聲波可以通過影響氫鍵、相互疏水作用來改變蛋白的三級結構，使更多的水解位點暴露于分子表面，促進亞基與水解酶充分接觸。Mónica[40]在高強度超聲條件下使用胰蛋白酶消化魚中的主要過敏原β-小清蛋白，結果顯示超聲處理使該過敏原酶解更徹底。另有研究顯示[41]，低頻超聲可使7S蛋白發(fā)生聚合，使其一級結構發(fā)生變化，聚合物的形成可能使抗原表位被掩蓋。

超聲波能改變蛋白質的空間結構，而大豆的致敏性與過敏原的空間結構緊密關聯(lián)，因此，超聲處理大豆過敏原勢必會導致其致敏性發(fā)生變化。雖然，目前國內外借助超聲波降低致敏性的研究很少，但其在降低大豆及其制品致敏性的應用方面很令人期待。

3 展望

加工能夠影響過敏原表位的結構，進而改變其致敏性，這是加工調控食物過敏原致敏性的重要支撐。如何采取有效的加工手段來降低或去除大豆及其制品的致敏性是解決大豆過敏的一項重要舉措。但某些單一的物理加工在降低大豆致敏性效果方面并不十分的理想，如輻照處理水分含量較低的過敏食品時很難降低其致敏性，而將各種物理加工以及物理-化學相結合的方法可顯著降低食品致敏性。另外，在食品過敏原蛋白的脫敏過程中，若從理論分析出發(fā)，將表位監(jiān)測和致敏性評估相結合，可以建立更加科學和精準的脫敏新技術。總之，在降低大豆致敏性方面，物理加工的工藝優(yōu)化和影響大豆致敏性機制等方面還有待進一步研究。

[1]Weihua W Y, Elvira Gonzalez de M, Zheng Huanyu, et al. Soybean allergens: presence, detection and methods for mitigation[J]. Soybean and Health, 2011, 20: 433-464.

[2]Alok K V, Sandeep K, Mukul D, et al. A comprehensive review of legume allergy[J]. Clinical Reviews in Allergy & Immunology, 2013, 45(1): 30-46.

[3]田斌強, 鄧乾春, 謝筆鈞, 等. 食品過敏原與過敏性消除方法[J]. 食品科技, 2007, 32(11): 9-13.

[4]Sun Xiulan, Shan Xiaohong , Yan Zihe , et al. Prediction and characterization of the linear IgE epitopes for the major soybean allergen β-conglycinin using immunoinformatics tools[J]. Food and Chemical Toxicology,2013, 56: 254-260.

[5]Wu Yongmei, Guan Rongxia, Liu Zhangxiong, et al. Synthesis and degradation of the major allergens in developing and germinating soybean seed[J]. Journal of Integrative Plant Biology , 2012, 54 (1): 4-14.

[6]Ricki M H, Gael C, Cathie C, et al. Mutational analysis of the IgE-binding epitopes of P34/Gly m Bd 30K[J].Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2000, 105(2): 378-384.

[7]Xiang Ping , Haas E J, Zeece M G, et al. C-Terminal 23 kDa polypeptide of soybean Gly m Bd 28 K is a potential allergen[J]. Planta, 2004, 220(1): 56-63.

[8]張銀, 佟平, 麻小娟,等. 熱加工及超高壓處理對卵白蛋白抗原性的影響[J]. 食品科學, 2010, 19(31):250-253.

[9]Wal J M. Thermal processing and allergenicity of foods[J]. Allergy, 2003, 58(8): 727-729.

[10]Wilson S, Martinez-Villaluenga C, Mejia E G D. Puri fi cation, thermal stability, and antigenicity of the immunodominant soybean allergen P34 in soy cultivars, ingredients, and products[J]. Journal of Food Science,2008, 73(6): 106-114.

[11]Tsuji H, Yamanishi R, Bando N, et al. Measurement of Gly m Bd 30k, a major soybean allergen, in soybean products by a sandwich enzyme-linked-immunosorbent-assay[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59(1): 150-151.

[12]Burks A W, Willians L W, Helm R M, et al. Identi fi cation of soy protein allergens in patients with atopic dermatitis and positive soy challenges; determination of change in allergenicity after heating or enzyme digestion[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1991, 289: 295-307.

[13]Javier A A, Eva G, Jesus F, et al. Effects of extrusion, boiling, autoclaving, and microwave heating on lupine allergenicity[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2005, 53(4): 1294-1298.

[14]Wilson S, Blaschek K, Mejia E G D. Allergenic proteins in soybean: processing and reduction of P34 allergenicity[J]. Special Article, 2005, 63(2): 47-58.

[15]Hanna M, Iwona G , Katarzyna S. Determination of acrylamide level in commercial baby foods and an assessment of infant dietary exposure[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(8): 2722-2728.

[16]Nie Shaoping, Huang Jungen, Zhang Yanan, et al. Analysis of furan in heat-processed foods in China by automated headspace gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS)[J]. Food Control, 2013, 30(1): 62-68.

[17]Vanesa G C, Noelia R C, Maria E L G, et al. Principal component analysis (PCA)and multiple linear regression (MLR)statistical tools to evaluate the effect of E-beam irradiation on ready-to-eat food[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2011, 24(3): 456-464.

[18]張明琪, 高美須, 支玉香, 等. 輻照對蟹過敏蛋白生化性質和抗原性的影響[J]. 中國農業(yè)科學, 2009,42(9): 3259-3264.

[19]顧可飛, 高美須, 李春紅, 等. 輻照降低食品致敏性的研究進展[J]. 核農學報, 2006, 20(6): 524-526.

[20]Shawrang P, Nikkhah A, Zare-Shahneh A, et al. Effects of gamma irradiation on protein degradation of soybean meal in the rumen[J]. Animal Feed Science and Technology, 2007, 134(1-2): 140-151.

[21]Peng I C, Dayton W R, Quass D W, et al. Investigations of soybean 11S protein and myosin interaction by solubility, turbidity and titration studies[J]. Journal of Food Science, 1982, 47 (6): 1976-1983.

[22]Mallikarjunan N, Sushama M, Deshpande R, et al. Influence of γ-radiation on the structure and function of soybean trypsin inhibitor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(48): 12036-12043.

[23]Ramkrashan K, Anand B S, Raj K, et al. Effect of thermal processing and γ-irradiation on allergenicity of legume proteins[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(10): 3456-3461.

[24]Samoto M, Fukuda Y, Takahashi K, et al. Substantially complete removal of three major allergenic soybean proteins (Gly m Bd 30K, Gly m Bd 28K, and the alpha-subunit of conglycinin)from soy protein by using a mutant soybean[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997 ,124 (64): 2148-2150.

[25]Manjaya J G, Suseelan K N, Gopalakrishna T, et al. Radiation induced variability of seed storage proteins in soybean [Glycine max(L.)Merrill][J]. Food Chemistry, 2007, 100(4): 1324-1327.

[26]王大毛. 小麥高壓處理的生物學效應[D]. 西北農林科技大學, 2010, 陜西.

[27]Li Huijing, Zhu Kexue, Zhou Huiming. Effect of high hydrostatic pressure treatment on allergenicity and structural properties of soybean protein isolate for infant formula[J]. Food Chemistry, 2012, 132(2): 808-814.

[28]Elena P, Guadalupe P, Florentino P, et al. Enzymatic proteolysis, under high pressure of soybean whey:Analysis of peptides and the allergen Gly m 1 in the hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2006, 99(3): 569-573.

[29]Elena P, Rosario G, Juana F. High hydrostatic pressure effects on immunoreactivity and nutritional quality of soybean products [J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 423-429.

[30]曾新安，劉燕燕. 脈沖電場對大豆分離蛋白溶液表面性質的影響[J]. 華南理工大學學報, 2009, 37(4):116-119.

[31]Li Yingqiu, Chen Zhengxing, Mo Haizhen. Effects of pulsed electric fields on physicochemical properties of soybean protein isolates[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40(7): 1167-1175.

[32]Li Yingqiu. Structure changes of soybean protein isolates by pulsed electric fields[J]. Physics Procedia,2012, 33: 132-137.

[33]劉燕燕，曾新安. 脈沖電場對大豆分離蛋白溶解性及亞基的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(7):77-80.

[34]Robert L B.Energetics of protein folding[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 371(2): 283-301.

[35]Sun Weiwei, Yu Shujuan, Jia Xiao, et al. Properties of whey protein isolate-dextran conjugate prepared using pulsed electric field[J]. Food Research International, 2011, 44(4): 1052-1058.

[36]郭孝武, 馮岳松. 超聲提取分離[M]. 北京, 化學工業(yè)出版社, 2008.

[37]Huang Huihua, Kin-Chor K, Liang Hanhua. Inhibitory activity and conformation changes of soybean trypsin inhibitors induced by ultrasound[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2008, 15(5): 724-730.

[38]Araeni C, Martínez K, Zema P, et al. Comparative study of high intensity ultrasound effects on food proteins functionality[J]. Journal of Food Engineering, 2012, 108(3): 463-472.

[39]Chen Lin , Chen Jianshe, Ren Jiaoyan, et al. Effects of ultrasound pretreatment on the enzymatic hydrolysis of soy protein isolates and on the emulsifying properties of hydrolysates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(6): 2600-2609.

[40]Mónica C, Benito C, Jose M G. Rapid direct detection of the major fish allergen, parvalbumin, by selected MS/MS ion monitoring mass spectrometry[J]. Journal of Proteomics, 2012, 75(11): 3211 -3220.

[41]Ramkrashan K, Anand B S, Raj K, et al. Effect of thermal processing and γ-irradiation on allergenicity of legume proteins[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(10): 3456-3461.