王小勇 陶承軍 袁丞達 王敏磊 應(yīng)航宇 任金平

siRNA 干擾水通道蛋白3和磷脂酶D2表達對A431細胞株生長和凋亡的影響

王小勇 陶承軍 袁丞達 王敏磊 應(yīng)航宇 任金平

目的探討水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）在人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431細胞增殖和凋亡中的作用。方法針對AQP3和PLD2各設(shè)計3條siRNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入A431細胞。用熒光定量PCR方法篩選出其中干擾效果最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA，Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后AQP3和PLD2蛋白的表達水平。將A431細胞分為5組：正常培養(yǎng)組（不加任何處理），轉(zhuǎn)染試劑組（加入轉(zhuǎn)染試劑），陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA），AQP3-siRNA組（轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA），PLD2-siRNA組（轉(zhuǎn)染PLD2-siRNA）。CCK8法檢測AQP3和PLD2表達下調(diào)對A431細胞增殖的影響，膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠雙染色后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結(jié)果用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入A431細胞后，AQP3和PLD2的mRNA和蛋白表達均較陰性對照組明顯下降。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA后A431細胞增殖在 24、48、72 h均受到明顯抑制（t值分別為 24.10、11.00、9.54，均P＜ 0.01）；轉(zhuǎn)染 PLD2-siRNA 后，A431細胞增殖同樣在24、48、72 h均受到明顯抑制（t值分別為30.47、7.02、8.73，均P＜0.01）。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA后，A431細胞凋亡在48 h和72 h均明顯增加（t值分別為11.36、20.91，均P＜0.01）；轉(zhuǎn)染PLD2-siRNA后，A431細胞凋亡在72 h明顯增加（t值為4.86，P＜0.05）。結(jié)論siRNA下調(diào)AQP3或PLD2表達可抑制A431細胞增殖，誘導(dǎo)A431細胞凋亡。

水通道蛋白質(zhì)3；磷脂酶D；RNA，小分子干擾；癌，鱗狀細胞；細胞系，腫瘤

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一類介導(dǎo)水分子跨膜運動的轉(zhuǎn)運蛋白的總稱，其中AQP3是皮膚中含量最豐富和主要的AQP［1］。研究表明，AQP3能促進人角質(zhì)形成細胞增殖和促進皮膚腫瘤發(fā)生［2］。磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一類脂肪分解酶，許多研究表明,PLD在一些腫瘤的發(fā)生、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移等過程中起著極其重要的作用［3］。AQP3和PLD2在功能上密切相關(guān)，具有協(xié)同作用。有研究顯示，AQP3和PLD2在皮膚腫瘤中異常表達，并且與細胞增殖有關(guān)［4］。本研究通過RNA干擾技術(shù)，阻斷AQP3和PLD2的表達，觀察轉(zhuǎn)染后人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431細胞增殖和凋亡的變化。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。AQP3-siRNA和PLD2-siRNA產(chǎn)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000試劑盒產(chǎn)自美國Gibco公司。CCK8試劑盒產(chǎn)自日本同仁化學(xué)社。膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（annexin-V-FITC/PI）細胞凋亡試劑盒產(chǎn)自美國Invitrogen公司。IQ SYBR Green Supermix定量PCR試劑產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。AQP3抗體和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體產(chǎn)自美國Bioworld公司，PLD2抗體產(chǎn)自美國Abgent公司。FACSVerse流式細胞儀產(chǎn)自美國BD公司。CFX connect適時PCR儀和ChemiDoc XRS+凝膠成像儀產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

二、方法

1.細胞轉(zhuǎn)染：siRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染按產(chǎn)品說明書進行。轉(zhuǎn)染前24 h將5×105個細胞接種到6孔板中，加入無抗完全培養(yǎng)基，細胞融合度為80%～90%時準備轉(zhuǎn)染。稀釋siRNA和LipofectamineTM2000，混勻，室溫下靜置20 min。將混勻的siRNA和LipofectamineTM2000加入到細胞培養(yǎng)板中，4～6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA先用不含RNA酶的蒸餾水配成 20 μmol/L，轉(zhuǎn)染時最終濃度為 0.05 μmol/L。

2.siRNA的篩選和驗證：針對AQP3和PLD2各設(shè)計3條siRNA，細胞轉(zhuǎn)染，用熒光定量PCR方法篩選出其中最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA。分別用AQP3-siRNA和PLD2-siRNA進行細胞轉(zhuǎn)染，用Western印跡法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后AQP3和PLD2蛋白的表達水平，進一步驗證干擾效果。將A431細胞分為5組：正常培養(yǎng)組（不加任何處理），轉(zhuǎn)染試劑組（加入轉(zhuǎn)染試劑），陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA），AQP3-siRNA組（轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA），PLD2-siRNA組（轉(zhuǎn)染PLD2-siRNA）。

3.熒光定量PCR：按相關(guān)產(chǎn)品說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后用Trizol-離心柱法提取轉(zhuǎn)染細胞總RNA，檢測純度和濃度。取1 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積20 μl，-70℃保存cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體積為 25 μl，50 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、59 °C 20 s、72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。AQP3上游引物序列為 5′-CCCCTCTGGACACTTGGAT-3′，下游為 5′-CACGAAGACACCCGCAAT-3′。PLD2 上游引物序列為 5′-GCCTTGGGCATCAACAGT-3′，下游引物序列為 5′-AGGTCAGTCAGTCGGTAGTG-3′。內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-AGAAGGCT GGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為 5′-AGGGGC CATCCACAGTCTTC-3′。用 2-ΔΔCt方法來分析和計算結(jié)果。

4.Western印跡分析：轉(zhuǎn)染24 h后按常規(guī)方法提取細胞總蛋白，-70°C保存。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為每泳道25 μg。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），封閉。孵育一抗，室溫2 h。孵育二抗，室溫1 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯影。實驗重復(fù)3次。導(dǎo)出照片后在Image J軟件下讀取各條帶吸光度值（A）。

5.CCK8法檢測細胞增殖：按試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染細胞在96孔板中培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。450 nm波長下，在酶標儀上測定各孔A值。實驗設(shè)6個復(fù)孔。細胞增殖率=（各實驗組A值/正常培養(yǎng)組A值）×100%。

6.Annexin-V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡：按試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24、48和72 h后，加入Annexin V-FITC，于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10 μl PI后，于2～8℃避光條件下孵育5 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗設(shè)3個復(fù)孔。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、siRNA的篩選和驗證

熒光定量PCR顯示，針對基因AQP3所設(shè)計的3條siRNA中，AQP3-siRNA-2對AQP3的干擾效果最佳，但該序列對PLD2基因也有抑制作用，故最終選擇AQP3-siRNA-1進行后續(xù)實驗。針對基因PLD2所設(shè)計的3條siRNA中，PLD2-siRNA-1具有對PLD2的最佳干擾效果，故選擇PLD2-siRNA-1序列進行后續(xù)實驗。

Western印跡顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA-1后，AQP3蛋白表達明顯下降（t=60.88，P＜ 0.01）； 轉(zhuǎn)染 PLD2-siRNA-1后，PLD2蛋白表達明顯下降（t=12.42，P＜ 0.01）。見圖 1、表 1。

二、AQP3和PLD2表達下調(diào)對A431細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA后，A431細胞增殖在24、48、72 h均受到明顯抑制（與陰性對照組比較，t值分別為24.10、11.00、9.54，均P＜ 0.01）。轉(zhuǎn)染 PLD2-siRNA后，A431細胞增殖同樣在24、48、72 h均受到明顯抑制（與陰性對照組比較，t值分別為30.47、7.02、8.73，均P＜0.01）。轉(zhuǎn)染試劑組和陰性對照組與正常培養(yǎng)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表 2。

三、AQP3和PLD2表達下調(diào)對A431細胞凋亡的影響

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染對A431細胞水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）蛋白表達的影響 1：正常培養(yǎng)組；2：轉(zhuǎn)染試劑組；3：陰性對照組；4：PLD2-siRNA組；5：AQP3-siRNA組

表1 siRNA轉(zhuǎn)染對A431細胞水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）蛋白表達的影響（±s）

表1 siRNA轉(zhuǎn)染對A431細胞水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。a：與陰性對照組比較，P＜0.01

細胞分組 AQP3/GAPDH灰度比值 PLD2/GAPDH灰度比值正常培養(yǎng)組 0.57±0.06 0.80±0.09轉(zhuǎn)染試劑組 0.59±0.06 0.80±0.09陰性對照組 0.52±0.05 0.81±0.09 PLD2-siRNA組 0.55±0.05 0.59±0.06a AQP3-siRNA組 0.28±0.04a 0.93±0.10

轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA或PLD2-siRNA在24 h時各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA后，A431細胞凋亡在48 h和72 h均明顯增加：與陰性對照組比較，48 h時t值為11.36，P＜0.01；72 h時t值為20.91，P＜0.01。轉(zhuǎn)染PLD2-siRNA后，A431細胞凋亡在72 h明顯增加（與陰性對照組比較，t值為4.86，P＜0.05）。轉(zhuǎn)染試劑組和陰性對照組與正常培養(yǎng)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞ 0.05）。見表2。

討 論

研究表明，AQP3在皮膚鱗狀細胞癌中高表達，并且與腫瘤的分化有顯著相關(guān)性［5］。亦有研究表明，AQP3在皮膚鱗狀細胞癌中呈“補丁樣”表現(xiàn)，即在腫瘤的某些區(qū)域高表達，在某些區(qū)域很少或沒有表達，而且這些表達下調(diào)的區(qū)域是腫瘤增生最活躍的區(qū)域，表明AQP3的下調(diào)能促進皮膚腫瘤的發(fā)生［4］。本實驗進一步證實，AQP3表達與皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡相關(guān)。

PLD及其水解產(chǎn)物均是重要的脂質(zhì)第二信使，在腫瘤的發(fā)病機制中可能起多重作用，但關(guān)于PLD與皮膚腫瘤關(guān)系的研究報道不多。研究發(fā)現(xiàn)，過度表達PLD2的成纖維細胞的形態(tài)學(xué)和生長特性均發(fā)生改變，即處于細胞周期S期的細胞比例增加，細胞周期蛋白D3的表達異常上調(diào)，表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化的特點［6］。既往研究表明，在A431細胞中有PLD1和PLD2的表達［7］，我們最近研究發(fā)現(xiàn)，浸潤性鱗狀細胞癌PLD2表達水平顯著高于正常表皮［8］。這些結(jié)果均表明PLD2的表達增加可能與皮膚惡性腫瘤的發(fā)病有關(guān)。而本實驗中用siRNA抑制PLD2的表達后，人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431細胞增殖受到抑制，細胞凋亡增加，也進一步證實PLD2對皮膚鱗狀細胞癌發(fā)生的促進作用。

在腫瘤治療中，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是一種重要的治療手段。本研究用siRNA干擾AQP3和PLD2的表達可誘導(dǎo)A431細胞凋亡，表明其在鱗狀細胞癌的治療中可能發(fā)揮作用。已有研究表明，PLD具有抗腫瘤細胞凋亡的作用，可能的機制有：通過激活哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）信號通路產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng)［9］；降低野生型P53蛋白的穩(wěn)定性進而抑制DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡［10］。抑制AQP3的表達亦能抑制皮膚腫瘤的發(fā)生，可能的機制有：減少甘油代謝和三磷酸腺苷產(chǎn)生［4］；減少局部黏著激酶（FAK）磷酸化，進而減少下游細胞外調(diào)解蛋白激酶（Erk）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化［11］；通過下調(diào)P53和上調(diào)Bcl-2和X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）抑制亞砷酸鹽誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡［12］。

表2 水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）表達下調(diào)對A431細胞增殖和凋亡的影響（%，±s）

表2 水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）表達下調(diào)對A431細胞增殖和凋亡的影響（%，±s）

注：統(tǒng)計學(xué)比較分析時，細胞增殖n=6，細胞凋亡n=3。與陰性對照組比較，a：P＜0.01，b：P＜0.05

細胞分組 24 h 48 h 72 h增殖率 凋亡率 增殖率 凋亡率 增殖率 凋亡率正常培養(yǎng)組 100.00±4.01 3.57±0.25 100.00±1.04 6.00±1.19 100.00±1.60 16.77±2.48轉(zhuǎn)染試劑組 98.95±3.25 3.79±0.93 96.94±3.55 6.97±0.62 96.25±6.24 18.73±3.91陰性對照組 98.51±3.29 4.15±0.89 93.41±5.64 6.13±0.19 96.21±3.88 17.60±1.65 AQP3-siRNA組 69.58±3.33a 4.43±0.32 59.09±3.03a 10.50±0.42a 75.72±4.35a 27.43±1.30a PLD2-siRNA組 64.07±4.37a 3.22±0.95 62.17±6.09a 5.20±1.56 76.54±4.11a 27.03±3.56b

AQP3和PLD2在結(jié)構(gòu)及功能上密切相關(guān)。AQP3和PLD2同時分布在角質(zhì)形成細胞膜上的富含小窩蛋白（caveolin）的區(qū)域［13］。AQP3 和 PLD2 作為一個整體，AQP3/PLD2信號分子相互作用，共同調(diào)節(jié)著角質(zhì)形成細胞的分化，其可能的機理是AQP3提供甘油給PLD2合成磷脂酰甘油，后者作為一種重要的脂質(zhì)信號促進角質(zhì)形成細胞的分化［14］。研究表明，異常的AQP3/PLD2信號與皮膚腫瘤的增殖有關(guān)，AQP3和PLD2的協(xié)同作用可能對皮膚腫瘤的發(fā)生更為重要［4］。在本研究中AQP3-siRNA和PLD2-siRNA轉(zhuǎn)染對于A431細胞增殖的抑制作用在48 h達到最大，在72 h有所降低，分析原因可能有兩個：一是在本實驗條件下，所設(shè)計的siRNA在72 h時已經(jīng)有部分降解，二是A431細胞本身有一定的增殖規(guī)律。在接下來的實驗中，我們將進一步研究聯(lián)合轉(zhuǎn)染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA對A431細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響以及這種影響的具體機制和作用環(huán)節(jié)。

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2013-12-11）

（本文編輯：尚淑賢）

Effects of interference with the expressions of aquaporin 3 and phospholipase D2 by small interfering RNAs on the proliferation and apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line A431

Wang Xiaoyong,Tao Chengjun,Yuan Chengda,Wang Minlei,Ying Hangyu,Ren Jinping.Department of Dermatology,Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China

；Wang Xiaoyong,Email；wangxiaoyong1974@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of aquaporin 3（AQP3）and phospholipase D2（PLD2）on the proliferation and apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line A431.MethodsThree small interfering RNAs（siRNAs）were constructed targeting the AQP3 and PLD2 genes separately,and transfected into A431 cells using liposomes.Then,fluorescence quantitative PCR was performed to find the most efficient siRNAs.Western blot was conducted to detect the protein expression levels of AQP3 and PLD2 in A431 cells after transfection with the selected AQP3-siRNA and PLD2-siRNA.Some A431 cells were divided into five groups；normal control group without any treatment,transfection reagent group treated with the oligofectamine reagent only,negative control group transfected with the negative control siRNA,AQP3-siRNA group transfected with the selected AQP3-siRNA,PLD2-siRNA group transfected with the selected PLD2-siRNA.After additional culture,cell counting kit-8 assay was performed to evaluate the proliferation of A431 cells,flow cytometry to detect the apoptosis of A431 cells after annexin V-fluorescein isocyanate/propidium iodide double-staining.Statistical analysis was carried out by the pairedttest.ResultsThe transfection with AQP3-siRNA and PLD2-siRNA induced a significant decrease in the mRNA and protein expressions of AQP3 and PLD2 respectively in A431 cells when compared with the untransfected cells.Compared with the negative control group,the proliferation of A431 cells was significantly decelerated at 24,48 and 72 hours after transfection in the AQP3-siRNA group（t=24.10,11.00,9.54,respectively,allP＜0.01）and PLD2-siRNA group（t=30.47,7.02,8.73,respectively,allP＜0.01）.A significant increase was observed in the apoptosis of A431 cells at 48 and 72 hours after transfection with AQP3-siRNA（t=11.36,20.91,respectively,bothP＜ 0.01）,and at 72 hours after transfection with PLD2-siRNA（t=4.86,P＜ 0.05）compared with the negative control group.ConclusionThe down-regulation of AQP3 and PLD2 expressions by siRNA can inhibit the proliferation,but induce the apoptosis,of A431 cells.

Aquaporin 3；Phospholipase D；RNA，small interfering；Carcinoma,squamous cell；Cell line,tumor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.002

2012年浙江省自然科學(xué)基金（LY12H11010）

310007杭州市中醫(yī)院皮膚科

王小勇，Email：wangxiaoyong1974@163.com