胡元慶，李鳳霞

(閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000)

彎曲菌是一種革蘭氏陰性桿菌，能引起散發(fā)性和地方流行性的人類胃腸炎，特殊血清型的空腸彎曲菌對具有免疫缺陷性的人群，如癌癥病人、艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，危害更加嚴(yán)重［1］。彎曲菌性腸炎潛伏期約為17d，主要臨床癥狀包括發(fā)熱、腹痛、水樣或粘液血性腹瀉以及嘔吐等［2］。另外，空腸彎曲菌被認(rèn)為是人類格林－巴利綜合征(Guillain－Barré syndrome，GBS)最主要的前驅(qū)致病因子［1］，發(fā)病主要是由于空腸彎曲菌的菌體成分可以與宿主的神經(jīng)節(jié)苷酯發(fā)生分子模擬，導(dǎo)致病人神經(jīng)麻痹甚至癱瘓，嚴(yán)重威脅到人類的健康［3－5］。20世紀(jì) 90年代國內(nèi)對彎曲菌檢測的研究報(bào)道較少，主要由于彎曲菌病的發(fā)生較罕見，畜禽病死率低，以及彎曲菌培養(yǎng)條件比較苛刻等原因。近年來，彎曲菌的感染率在世界各地呈上升趨勢，特別是歐美發(fā)達(dá)國家的禽肉食品污染比較嚴(yán)重［6］。發(fā)展中國家空腸彎曲菌污染食品的案例報(bào)道相對較少，主要是引起部分人群的腹瀉及腸炎，但隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，空腸彎曲菌污染肉類食品的事件逐年增多［6］。建立空腸彎曲菌快速特異的分離檢測方法，提高食品中空腸彎曲菌的檢出效率，可有效控制畜產(chǎn)品在生產(chǎn)和消費(fèi)中受空腸彎曲菌的污染，有助于從根本上預(yù)防控制人畜共患空腸彎曲菌病的發(fā)生。本文將綜述空腸彎曲菌檢測方法及技術(shù)的最新研究進(jìn)展。

1 常規(guī)分離鑒定方法

空腸彎曲菌的體外培養(yǎng)需要較為苛刻的條件，尤其要求嚴(yán)格的氣體環(huán)境。早在1957年King等就已發(fā)現(xiàn)彎曲菌與人類腸炎的發(fā)生密切相關(guān)，但直到Skirrow和Blaster使用能抑制腸道中背景菌群的培養(yǎng)基后，該屬細(xì)菌的檢出率才得以提高［7］。

彎曲菌常規(guī)分離鑒定方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性分離和生化鑒定。革蘭氏染色、細(xì)菌動力觀察、過氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等可將彎曲菌鑒定到屬的水平。而更精確的種特異性鑒定則需要做更多的生化試驗(yàn)，如硝酸鹽水解試驗(yàn)、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)、吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)、萘啶酸和頭孢菌素敏感性試驗(yàn)等。確定彎曲菌的屬后，可使用API Campy生化鑒定試劑盒或VITEK－NH生化鑒定卡來進(jìn)行種特異性鑒定［8］。近年來，還出現(xiàn)了 Micro－ID 系統(tǒng)、Enterotube系統(tǒng)和Mnitek系統(tǒng)等，從而使得空腸彎曲菌鑒定更簡易化、微量化和快速化。用生化方法鑒別空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的唯一指標(biāo)是馬尿酸鹽水解試驗(yàn)，其中空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗(yàn)呈陽性。也有報(bào)道顯示，約10% 的空腸彎曲菌分離株在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下失去分解馬尿酸鹽的能力［9］。盡管生化方法是目前微生物學(xué)手段鑒定空腸彎曲菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實(shí)際應(yīng)用中很難保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 核酸檢測方法

2.1 基因芯片

基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因序列分析、雜交、基因突變檢測和多態(tài)性分析、基因組文庫圖型分析以及疾病的基因診斷等領(lǐng)域。該技術(shù)可將大量不同的探針固定于同一支持物上，一次性對同一樣品進(jìn)行序列監(jiān)測和核酸分析［10－11］。Georgios Keramas 等［12］使用一種敏感的DNA芯片快速檢測泄殖腔拭子樣品中的彎曲菌。姜海等［13］利用細(xì)菌種屬特異性基因、重要毒力基因以及目前已經(jīng)可區(qū)分菌株亞型的基因作為靶基因探針制備基因芯片，并通過雜交反應(yīng)檢測常見腸道致病菌。王金玲等［14］依據(jù) 16S rRNA、23S rRNA上的恒定區(qū)和可變區(qū)設(shè)計(jì)7種致病菌的通用引物和特異性寡核苷酸探針，并對探針5'端氨基化修飾后與基因芯片共價(jià)結(jié)合，然后優(yōu)化雜交反應(yīng)液、芯片點(diǎn)樣及后處理程序，研制出能同時(shí)檢測動物性食品中7種主要致病菌的基因芯片。國內(nèi)尤元海等［15］依據(jù)不同腸道病原菌毒力基因建立了一種基因芯片方法，可以檢測大腸桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌和腸炎耶爾森氏菌，該技術(shù)具有高效快速實(shí)用等特點(diǎn)，尤其適合檢測腹瀉病人的感染菌?；蛐酒夹g(shù)雖然有多方面的優(yōu)越性，但在實(shí)際應(yīng)用中存在檢測成本高、設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格等的局限性，所以不能廣泛用于基層單位的檢測工作。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加上兩對或兩對以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增多個核酸片段的PCR反應(yīng)，它具有高效、系統(tǒng)和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，所以在多種病原微生物的同步檢測和鑒定方面得到廣泛應(yīng)用。常選用的靶基因有16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因(ceuE)、細(xì)胞擴(kuò)張毒素基因 cdt等［16］。Van Camp G H等［17］使用PCR的方法擴(kuò)增彎曲菌的16S rRNA基因?qū)υ摷?xì)菌進(jìn)行鑒定。何蕊等［18］以16S rRNA、mapA和ceuE為靶基因，建立檢測空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的多重PCR方法。同時(shí)使用該方法對180份生鮮雞肉樣品進(jìn)行檢測，共檢測出空腸彎曲菌陽性樣品43份，結(jié)腸彎曲菌陽性樣品12份。結(jié)果表明，多重PCR方法具有快速、簡便、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化鑒定和血清學(xué)方法的不足，為彎曲菌檢測提供新的技術(shù)。國內(nèi)侯建軍等［19］以空腸彎曲菌VS1基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了能與其他食品污染菌相區(qū)別的PCR檢測方法，其靈敏度達(dá)6CFU/mL，該方法具有高效、靈敏、特異和穩(wěn)定的特點(diǎn)。

近年出現(xiàn)了多重PCR的改進(jìn)方法，如多重PCR－變性高效液相色譜(mPCR－ HPLC)［20］。與常規(guī)mPCR－凝膠電泳檢測技術(shù)不同，mPCR－HPLC經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，使用DHPLC技術(shù)分辨分子大小［21］。根據(jù)分子對固定相親和力的差異，用流動相洗脫時(shí)不同大小或者不同序列的核苷酸分子在固定相上移動速率不同檢測目的片段。該技術(shù)靈敏度和特異性較高，產(chǎn)物分子量1%大小的片段即能夠被分離檢出，克服了凝膠電泳檢測技術(shù)中產(chǎn)物條帶較弱，擴(kuò)增片段大小相近時(shí)，難以肉眼準(zhǔn)確判定結(jié)果的不足。Franciosa等［22］報(bào)道了利用變性高效液相色譜鑒定肉毒桿菌神經(jīng)毒素A、B、E和F型基因的研究，并指出DHPLC技術(shù)可以用于食品病原微生物的檢測。曹際娟等［23］在國內(nèi)首次報(bào)道了用DHPLC進(jìn)行的微生物檢測研究，對動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行高通量檢測。徐君怡等［24］采用非變性DHPLC技術(shù)，建立了食品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的特異性吸收譜圖，利用mPCR－DHPLC方法對彎曲菌進(jìn)行快速檢測的研究。PCR技術(shù)與其它相關(guān)生物檢測手段聯(lián)合使用，是其發(fā)揮穩(wěn)定性和特異性的新方向，未來開發(fā)的重點(diǎn)應(yīng)是適合基層檢測應(yīng)用的聯(lián)合新技術(shù)開發(fā)和優(yōu)化，使檢測范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，檢測成本保持較低水平。

2.3 套式PCR

套式PCR是用內(nèi)、外兩套引物進(jìn)行兩次PCR，第一次PCR產(chǎn)物作為第二次PCR的模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，該方法克服了一對引物擴(kuò)增產(chǎn)量低而造成假陰性的缺點(diǎn)，大大提高了PCR擴(kuò)增的靈敏度。高正琴等［25］建立了套式PCR檢測空腸彎曲菌的方法，并初步應(yīng)用該方法對實(shí)驗(yàn)動物空腸彎曲菌進(jìn)行檢測，最低限度為10CFU/mL，整個檢測過程在8h內(nèi)完成，從121份臨床樣品中共檢出31份陽性，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法一致。該方法與常規(guī)PCR方法相比，可從極少量模板中獲得高濃度和高純度的靶基因片段，其敏感性較常規(guī)PCR提高100倍以上。

2.4 PCR－ELISA

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們不再滿足于PCR的定性測定，在凝膠電泳的基礎(chǔ)上使用掃描照片進(jìn)行光密度分析，實(shí)現(xiàn)PCR的相對定量。但由于普通凝膠電泳檢測技術(shù)本身的特異性較低，只能對樣品進(jìn)行粗略的相對定量。隨著固相捕獲技術(shù)的成熟和應(yīng)用，尤其是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的成功，給核酸定量提供了一個新思路，固相捕獲的PCR－ELISA技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。經(jīng)PCR擴(kuò)增以后，在微孔板上借用ELISA的原理，用酶標(biāo)抗體進(jìn)行固相雜交來實(shí)現(xiàn)定量［26］。Sails A D 等［27］使用 CJ2 和CC2 兩個探針來檢測彎曲菌。用同一對引物擴(kuò)增目的基因，PCRELISA的靈敏度比以凝膠為基礎(chǔ)的PCR高10～100倍，其靈敏度可達(dá)到1.5fg DNA。結(jié)果表明該方法具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，并大大降低了鑒定彎曲菌所需的時(shí)間，可用于食品和環(huán)境樣品中彎曲菌的檢測。

2.5 Real－time PCR

Real－time PCR即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是在PCR基礎(chǔ)上建立的一項(xiàng)新技術(shù)，由于它具有操作簡便、快速高效的特點(diǎn)，同時(shí)具有很高的敏感性和特異性，已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。Real－time PCR在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來實(shí)時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。該技術(shù)使用的熒光探針有分子信標(biāo)、Taqman探針和SYBR Green I等。其中分子信標(biāo)和Taqman探針法的熒光信號是特異的，檢測成本也較高;而SYBR Green I法中的熒光信號是非特異的，通過熒光染料與dsDNA的結(jié)合而發(fā)出熒光，繼而通過儀器自動檢測出熒光信號增長曲線［28］。

Chengbo Yang等［29］建立實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測不經(jīng)增菌處理的禽肉食品、牛奶和環(huán)境水樣中的彎曲菌。整個反應(yīng)在1h之內(nèi)完成，且最低檢出限為1CFU/mL。在300份禽肉樣品中檢出92份空腸彎曲菌陽性，300份牛奶樣品中檢出82份空腸彎曲菌陽性，300份環(huán)境水樣中檢出41份空腸彎曲菌陽性。Emma L.Best等［30］也建立了快速、特異、敏感的方法來對空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行檢測。Josefsen等［31］建立了一種細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)合Real－time PCR檢測雞肉樣品中空腸彎曲菌的技術(shù)，可在3h內(nèi)檢測到活的或者VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，但不能檢測死亡彎曲菌的 DNA。Leblanc－Maridor M 等［32］建立了從糞便、食品和環(huán)境樣品中檢測空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的Real－time PCR方法，其靈敏度可達(dá)10個基因組拷貝，能作為研究彎曲菌流行病學(xué)的可靠技術(shù)。

3 免疫學(xué)檢測方法

3.1 IMC－FPCR

免疫磁性分離技術(shù)(Immunomagnetic Separation，IMS)是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合形成抗原－抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在磁場的作用下定向移動，從而達(dá)到分離抗原的目的。IMC－FPCR為磁珠捕獲－熒光PCR，它是應(yīng)用抗血清和磁性微珠制備彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠來捕獲檢樣中目的菌的特定基因［33］。它具有簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)且抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)而得到應(yīng)用，該方法可望解決非可培養(yǎng)狀態(tài)空腸彎曲菌檢測的難題。Liu G等［34］針對flaA基因hipO基因設(shè)計(jì)兩對引物，建立磁珠捕獲－熒光PCR檢測空腸彎曲菌的方法，對300份食品樣品和100份水樣品進(jìn)行檢測，在食品樣品中檢測出4份陽性，結(jié)果與傳統(tǒng)的方法一致;在100份水樣品中檢測出1份陽性，而傳統(tǒng)方法沒有檢出陽性，同時(shí)該方法也可用于VBNC(存活非可培養(yǎng))狀態(tài)下空腸彎曲菌的檢測。David F等［35］建立磁捕獲－熒光PCR對食品中的空腸彎曲菌進(jìn)行檢測，可檢出的最少細(xì)菌數(shù)，比不用MS富集的方法低一個數(shù)量級。隨著科學(xué)的發(fā)展，免疫磁珠還可以與熒光定量PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)等結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特殊的檢測目的，為彎曲菌的檢測提供更加高效的手段。

3.2 ELISA

Taylor等［36］用空腸彎曲菌 NCTC11168的主要外膜蛋白制備了多價(jià)血清并建立了ELISA檢測方法，這種多價(jià)血清可以和空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和海鷗彎曲菌三種彎曲菌反應(yīng)。Griffiths等［37］利用種特異性多價(jià)血清建立了Dot－ELISA方法，可以區(qū)分空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和海鷗彎曲菌。黎誠耀等［38］以方陣滴定法確定了空腸彎曲桿菌抗血清、酶結(jié)合物的最佳工作濃度和孵育時(shí)間，從而建立了快速檢測空腸彎曲菌的間接ELISA方法，對144份雞泄殖腔糞便標(biāo)本和116份豬直腸糞便標(biāo)本的選擇性增菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行了檢測，陽性率分別為83.3%和79.3%，可于28h內(nèi)報(bào)告結(jié)果。黎誠耀等［39］還應(yīng)用酶標(biāo)抗體染色法檢測空腸彎曲菌，結(jié)果表明該方法具有較高的特異性及敏感性，在對47份雞糞便樣本和38株豬糞便樣本進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果相同，該空腸彎曲菌的酶標(biāo)抗體染色檢測法可在2h內(nèi)完成。

另外，許多學(xué)者研制了針對彎曲菌多種抗原的單克隆抗體，以此建立ELISA的檢測方法。Monfort J D［40］建立了基于空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌鞭毛抗原單克隆抗體的ELISA方法，可以直接從泄殖腔棉拭子中檢測彎曲菌。Steele［41］制備了針對空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解酶的單克隆抗體，結(jié)果表明其特異性較好。Brooks［42］制備了針對LPS的單克隆抗體，特異性較好。韓文瑜等［43］應(yīng)用空腸彎曲菌共同抗原的單克隆抗體，以BA－ELISA法對雞和豬的胴體表面、臟器及泄殖腔樣本中的空腸彎曲菌進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明該方法具有較強(qiáng)的特異性和敏感性。

4 噬菌體受體蛋白捕獲技術(shù)

Amit Singh等［44］建立了用噬菌體受體結(jié)合蛋白捕獲空腸彎曲菌的技術(shù)，GP48RBP蛋白首先通過谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的方式得以表達(dá)，然后被固定到等離子表面共振器上，用其捕獲待檢樣品中的細(xì)菌。結(jié)果表明:該技術(shù)具有較好的捕獲特異性，最低檢測限為102CFU/mL。后續(xù)的研究也將該技術(shù)與磁珠結(jié)合，用于捕獲未被濃縮的檢測樣品。Muhammad A.Javed等［45］對空腸彎曲菌的噬菌體NCTC12673全基因組進(jìn)行了分析，確定了GP047是結(jié)合宿主的重要受體蛋白，對該蛋白C－端四分之一氨基酸區(qū)表達(dá)(CC GP047)，然后用其在玻片上積聚彎曲菌，這個積聚過程可以再幾分鐘內(nèi)完成，其對彎曲菌的特異性識別達(dá)到100%，其中對空腸彎曲菌的特異性為95%，對結(jié)腸彎曲菌為90%。然后對CC GP047表達(dá)為綠色熒光融合蛋白，可以通過熒光顯微鏡來分析被吸附的彎曲菌。

5 展望

人感染彎曲菌的主要途徑是食用未煮熟的禽肉，通常為散發(fā)。彎曲菌病的爆發(fā)主要由飲用污染的水源或牛奶引起。由于空腸彎曲菌對環(huán)境的抵抗力較弱，不管是哪種途徑感染，污染的樣品攜帶空腸彎曲菌的數(shù)量都很低，給空腸彎曲菌的風(fēng)險(xiǎn)評估帶來一些困難。目前，較為實(shí)用的檢測方法是細(xì)菌分離培養(yǎng)配合PCR鑒定，檢測快速且成本相對較低，但經(jīng)常有漏檢的情況發(fā)生。所以開發(fā)更靈敏、更特異、更快速的彎曲菌檢測方法是預(yù)防該菌感染人的重要手段。近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、電化學(xué)的快速發(fā)展，尤其是幾種學(xué)科的交叉研究，新的彎曲菌檢測方法不斷產(chǎn)生。未來對空腸彎曲菌檢測方法的研究主要關(guān)注以下幾個方面:為克服細(xì)菌含量低而開發(fā)的新型富集方法和前增菌方法;空腸彎曲菌新的、更特異檢測抗原的發(fā)現(xiàn);高通量檢測方法的建立，如基因芯片方法等。

［1］Nachamkin I.Chronic effects of Campylobacter infection［J］.Microbes and Infection，2002，4(4):399－403.

［2］Zilbauer M，Dorrell N，Wren BW，et al.Campylobacter jejunimediated disease pathogenesis:an update［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，2008，102(2):123－129.

［3］Nyati KK，Prasad KN，Kharwar NK，et al.Immunopathology and Th1/Th2 immune response of Campylobacter jejuni－induced paralysis resembling Guillain－Barre syndrome in chicken［J］.Med Microbiol Immunol，2012，201(2):177－187.

［4］Louwen R，Horst－Kreft D，De Boer AG，et al.A novel link between Campylobacter jejuni bacteriophage defence，virulence and Guillain－ Barre syndrome［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2013，32(2):207－226.

［5］Islam Z，Gilbert M，Mohammad QD，et al.Guillain－Barre Syndrome－ Related Campylobacter jejuniin Bangladesh:Ganglioside Mimicry and Cross－ Reactive Antibodies［J］.PLoS One，2012，7(8):e43976.

［6］Humphrey T，O’Brien S，Madsen M.Campylobacters as zoonotic pathogens:A food production perspective［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，117(3):237－257.

［7］Kist M.Proceedings of the third iniemational workshop on Campylobacter infections［C］.The history background of Campylobacter jejuni，1985，7:23－27.

［8］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)［S］.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)——空腸彎曲菌檢驗(yàn) .GB/T 4789，9－2008:59－66.

［9］Englen MD，Ladely SR，F(xiàn)edorka－Cray PJ.Isolation of Campylobacter and identification by PCR［J］.Methods Mol Biol，2003，216:109－121.

［10］Ludwig W，Schleifer KH.Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis［J］.FEMS Microbiol Rev，1994，15(2－3):155－173.

［11］Shi YH，Chen J，Li CH，et al.Detection of bacterial pathogens in aquaculture samples by DNA microarray analysis［J］.Aquaculture，2012，338－341:29－35.

［12］Georgios K，Bang DD，Lund M.Development of a sensitive DNA microarray suitable for rapid detection of Campylobacter spp.［J］.Molecular and Cellular Probes，2003，8(17):187－196.

［13］姜海，曾潯，尤元海，等.腸道常見病原菌檢測基因芯片的制備與評價(jià)［J］.中國公共衛(wèi)生，2006，10(22):1197－1198.

［14］王金玲，曹際娟，喬洪偉，等.應(yīng)用基因芯片檢測動物性食品中主要致病菌［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，7(27):485－489.

［15］尤元海，曾潯，過瑋，等.重要腸道病原菌多重PCR－基因芯片檢測方法研究［J］.中國生物工程雜志，2009，29(12):79－84.

［16］You YH，F(xiàn)u CX，Zeng X，et al.A novel DNA microarray for rapid diagnosis of enteropathogenic bacteria in stool specimens of patients with diarrhea［J］.Journal of Microbiological Methods，2008，75:566－571.

［17］Van Camp GH，F(xiàn)ierens H，Vandamme P，et al.Identification of enter pathogenic Campylobacter species by oligonucleotide probes and polymerase chain reaction based on 16S rRNA genes［J］.Syst Appl Microbiol，1993，16:30－36.

［18］何蕊，黃金林，許海燕，等.彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2007，28(1):5－7.

［19］侯建軍，朱建國，華修國，等.動物及其產(chǎn)品中空腸彎曲菌PCR檢測方法的建立［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(2):128－131.

［20］Shiramaru S，Asakura M，Inoue H，et al.A cytolethal distending toxin gene－based multiplex PCR assay for detection of Campylobacter spp.in stool specimens and comparison with culture method［J］.J Vet Med Sci，2012，74(7):857－862.

［21］Colosimo A，Guida V，F(xiàn)lex E，et al.Use of DHPLC for rapid screening of recombinan clones［J］.Biotechniques，2003，34:706－708.

［22］Franciosa G，Pourshaban M，De Luca A，et al.Identification of type A、B、E、and F botulinum neurotoxin genes and of botulinum neurotoxigenic clostridia by denaturing highperformance liquid chromatography［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70:4170－4176.

［23］曹際娟，徐君怡，孫哲平，等.變性高效液相色譜高通量檢測動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌［J］.飼料工業(yè)，2008，29:50－53.

［24］徐君怡，曹際娟，鄭秋月，等.多重PCR－變性高效液相色譜檢測食品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，3(31):207－212.

［25］高正琴，張強(qiáng)，邢進(jìn)，等.空腸彎曲菌套式PCR快速檢測方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(12):727－730.

［26］Li YH，Cao L，Zhang C，et al.Development and evaluation of a PCR－ELISA assay for the detection and quantification of Cronobacter spp［J］.International Dairy Journal，2013，33(1):27－33.

［27］Sails AD，F(xiàn)ox AJ，Bolton FJ，et al.Development of a PCR ELISA assay for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli［J］.Molecular and Cellular Probe，2001，15:291－300.

［28］Toplak N，Kova cˇl M，Piskernik S，et al.Detection and quantification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli using real－ timemultiplexPCR［J］.JournalofApplied Microbiology，2012，112(4):752－764.

［29］Yang CB，Jiang Y，Huang KH.Application of real－time PCR for quantitative detection of Campylobacter jejuni in poultry，milk and environmental water［J］.FEMS Immunology and Medical Microbiology，2003，10(38):265－271.

［30］Best EL，Powell EJ，Swift C，et al.Applicability of a rapid duplex real－time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates［J］.FEMS Microbiology Letters，2003，12(229):237－241.

［31］JosefsenMH，Lofstrom C，HansenTB，etal.Rapid Quantification of Viable Campylobacter Bacteria on Chicken Carcasses，Using Real－ Time PCR and Propidium Monoazide Treatment，as a Tool for Quantitative Risk Assessment［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76(15):5097－5104.

［32］Leblanc－Maridor M，Beaudeau F，Seegers H，et al.Rapid identification and quantification ofCampylobactercoliand Campylobacter jejuni by real－time PCR in pure cultures and in complex samples［J］.BMC Microbiology，2011，11:113.

［33］Le Ly Thuy Tram，Cuong Cao，Jonas H?gberg，et al.Isolation and detection of Campylobacter jejuni from chicken fecal samples by immunomagnetic separation－ PCR［J］.Food control，2012，24(1－2):23－28.

［34］Liu G，Han Y，Li X，et al.Applicability of a rapid method based on immunomagnetic capture－fluorescent PCR assay for Campylobacter jejuni［J］.Food Control，2006，17:527－532.

［35］David FS.A quantitative immunocapture PCR assay for detection ofCampylobacterjejuniin foods［J］.Applied Environment Microbiology，2000(66):4115－4118.

［36］Taylor DE，Chang N.Immunoblot and enzyme－ linked immunosorbant assays of Campylobacter major outer membrane protein and application to the differentiation of Campylobacter species［J］.Mol Cell Probes，1987，1:261－274.

［37］Griffiths PL，Moreno GS，Park RW.Differentiation between thermophilic Campylobacter species by species－specific antibodies［J］.Appl Bacteriol，1992，72:467－474.

［38］黎誠耀，王世若，宋耀彬，等.間接ELISA對雞豬空腸彎曲菌快速檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，7(1):28－34.

［39］黎誠耀，王世若，宋耀彬，等.應(yīng)用酶標(biāo)抗體染色法實(shí)驗(yàn)檢定空腸彎曲菌［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1988，8(2):131－134.

［40］Monfort JD，Bech－Neilsen S，Stills HF.Detection of flagella antigen of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in canine faeces with an enzyme－linked immunosorbant assay(ELISA)－new prospect for diagnosis［J］.Vet Res Commun，1994，18:85－92.

［41］Steele M，Gyles C，Chan VL，et al.Monoclonal antibodies specific for hippurate hydrolase of Campylobacter jejuni［J］.Clin Microbiol，2002，40:1080－1082.

［42］Brooks BW，Mihowich JG，Blais BW，et al.Spcecificity of monoclonal antibodies to Campylobacter jejuni lipopolysaccharidide antigens［J］.Immunol Invest，1998，27:257－265.

［43］韓文瑜，黎誠耀，王世若，等.BA－ELISA檢測空腸彎曲菌的研究［J］.中國獸醫(yī)科技，1990，8:5－7.

［44］Singh A，Arutyunov D，McDermott MT，et al.Specific detection of Campylobacter jejuni using the bacteriophage NCTC 12673 receptor binding protein as a probe［J］.Analyst，2011，136(22):4780－4786.

［45］Javed MA，Poshtiban S，Arutyunov D，et al.Bacteriophage Receptor Binding Protein Based Assays for the Simultaneous Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli［J］.2013，PLoS One 8(7):e69770.