胡 燕，齊桂年

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安625014)

黑茶是我國六大茶類之一，屬于后發(fā)酵茶，以邊銷為主，主產(chǎn)區(qū)為湖南、四川、云南、湖北、廣西等省［1］。過去對黑茶的研究主要集中在品質(zhì)化學(xué)成分［2－3］、加工過程中微生物種群的分離鑒定［4］和降氟技術(shù)［5］等方面;現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)對黑茶質(zhì)量的評價主要是測定水分、總灰分、水浸出物等理化指標(biāo)并結(jié)合感官審評［6－8］，難以全面反映其質(zhì)量。

化學(xué)指紋圖譜是指在固定的實驗條件下將待測物經(jīng)適當(dāng)處理后得到的能標(biāo)示其化學(xué)特征的譜圖［9］，其中的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜可用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制、新藥開發(fā)等領(lǐng)域［10－11］，但應(yīng)用于黑茶的研究較少［12－14］。二極管陣列檢測器(DAD)是HPLC中較常用的紫外檢測器，但無法直接檢測茶葉中的氨基酸類和多糖類等無紫外吸收或僅有弱紫外吸收的組分［15－16］，同時，對于紫外特征吸收有差異的各物質(zhì)往往不能在同一檢測波長下同時得到很好的響應(yīng);蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)作為一種通用型質(zhì)量檢測器，產(chǎn)生的響應(yīng)只與分析成分的質(zhì)量相關(guān)，而不依賴于其光學(xué)性質(zhì)［17］，而且在梯度洗脫時流動相不產(chǎn)生背景干擾，克服了傳統(tǒng)紫外檢測器的不足，但靈敏度低于DAD。考慮到黑茶樣品中同時含有紫外吸收和無紫外吸收的組分，本研究擬運(yùn)用HPLC－DAD－ELSD聯(lián)用技術(shù)，構(gòu)建我國黑茶的HPLC－DAD－ELSD指紋圖譜，以期更全面地反映我國黑茶中非揮發(fā)性成分的化學(xué)特征，并為對我國黑茶的鑒別和質(zhì)量的客觀評價提供一種新的思路。

1 材料與方法

表1 茶樣及來源Table 1 Tea samples and the origin

1.1 材料與儀器

試驗采用的黑茶成品樣取自我國6個黑茶主產(chǎn)地的18個不同廠家，每個產(chǎn)地取6個茶樣，共計36個樣品，生產(chǎn)年份均為2012年;并選取2012年生產(chǎn)的其它5大茶類的樣品各一個，普洱生茶樣品一個作為對照，樣品來源見表1。

甲醇 色譜純，美國Fisher公司;水 超純水;三氟乙酸 色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;谷氨酸(CAS號:56－86－0)、L－茶氨酸(CAS 號:3081－61－6)、沒食子酸(CAS 號:149－91－7)、咖啡因(CAS號:58－08－2)、表沒食子兒茶素(EGC)(CAS 號:970－74－1)、兒茶素(C)(CAS 號:154－23－4)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)(CAS號:989－51－5)、表兒茶素(EC)(CAS號:490－46－0)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)(CAS號:4233－96－9)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)(CAS號:1257－08－5)對照品 均購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

Dionex Ultimate3000U高效液相色譜儀 配有雙三元輸液泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器(DAD)美國Dionex公司;變色龍軟件Chromeleon7.1 美國Dionex公司;Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)美國奧泰科技中國有限公司;XWK－Ⅲ無油空氣泵 天津市津分分析儀器制造有限公司;超聲波清洗器 上海冠特超聲波儀器有限公司;電子天平 德國賽多利斯股份公司;臺式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;微型植物實驗粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;arium comfortⅠ純水機(jī) 德國賽多利斯股份公司。

1.2 色譜條件

流動相A:0.1%的三氟乙酸水溶液;流動相B:甲醇。色譜柱:Thermo scientific C18色譜柱(5μm，250mm×4.6mm)。DAD檢測波長:280nm。柱溫:30℃。流速:1.0mL/min。ELSD采用不分流模式，漂移管溫度:110℃，空氣流量:2.8L/min。分析時間:65min。

梯度洗脫程序:0～3min，3%B;3～8min，3%B～8%B;8～15min，8%B～17%B;15～20min，17%B～20%B;20～27min，20%B～22%B;27～33min，22%B～33%B;33～39min，33%B～38%B;39～44min，38%B～43%B;44～53min，43%B～70%B;53～60min，70%B～30%B;60～65min，30%B～3%B。系統(tǒng)平衡色譜柱時間:15min。

1.3 樣品前處理

稱取2.00g粉碎茶樣(過40目篩)于250mL具塞錐形瓶中，加入140mL 90℃的超純水，立即移入90℃水浴中浸提15min，每隔5min搖動一次。浸提完畢后，冷卻至室溫，離心15min(轉(zhuǎn)速4000r/min)，取上清液用0.45μm水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLCDAD－ELSD分析，進(jìn)樣量為20μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將黑茶樣品的HPLC－DAD－ELSD圖譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)軟件中，生成我國黑茶的HPLC－DAD和HPLCELSD指紋圖譜共有模式并計算黑茶樣品及對照茶樣與黑茶指紋圖譜共有模式的相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

將36個黑茶樣品的 HPLC－DAD和 HPLCELSD色譜圖數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)軟件中，生成我國黑茶的HPLC－DAD和HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式(圖1、圖2)，在圖1中選擇出峰時間適中、峰面積在色譜圖中所占比例較大且在各黑茶樣品中均穩(wěn)定存在的13號峰作為參照峰;在圖2中選擇在各黑茶樣品中均穩(wěn)定存在的10號峰作為參照峰。

圖1 我國不同產(chǎn)地黑茶的HPLC－DAD指紋圖譜共有模式Fig.1 Common pattern simulated from HPLC－DAD fingerprinting of dark teas from different regions in China(common peaks:1～27)

圖2 我國不同產(chǎn)地黑茶的HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern simulated from HPLC－ELSD fingerprinting of dark teas from different regions in China(common peaks:1～15)

2.1.1 精密度試驗 取同一份黑茶樣品按1.3制備，在1.2的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以圖1中的13號峰為參照峰，測得HPLC－DAD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.12%～1.05%和0.66%～1.85%;以圖2中的10號峰為參照峰，測得HPLC－ELSD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.91%～2.77%和1.02%～2.94%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗 取同一黑茶樣品5份，按1.3平行制備，在1.2的色譜條件下分別進(jìn)樣分析，按照與2.1.1相同的圖譜數(shù)據(jù)處理方法，測得HPLC－DAD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.17%～1.35%和0.89%～2.45%;HPLC－ELSD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.88%～2.81%和0.94%～2.82%，表明該提取方法的重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份黑茶樣品按1.3制備，分別在0、2、4、8、12、16、20、24h 不同時間點，按 1.2的色譜條件進(jìn)樣分析，按照與2.1.1相同的圖譜數(shù)據(jù)處理方法，測得HPLC－DAD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.88%～2.24%和1.38%～2.73%，HPLC－ELSD圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為1.23%～2.88%和1.54%～2.96%，表明樣品提取液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 ELSD檢測參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 漂移管溫度的選擇 漂移管溫度影響ELSD的響應(yīng)，當(dāng)漂移管溫度較低時溶劑揮發(fā)不完全，背景噪聲較大，隨著溫度的升高流動相蒸發(fā)趨于完全，信噪比增加，但溫度過高時可能會導(dǎo)致待測組分的部分汽化，有效信號響應(yīng)值變?。?8］。該試驗在固定霧化氣體流速及不分流模式下，考察了漂移管溫度分別為90、95、100、105、110、115、120℃時對各組分峰響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，大部分組分峰的ELSD響應(yīng)值增大，當(dāng)溫度達(dá)到105℃后，隨著溫度的升高響應(yīng)值變化不明顯，當(dāng)溫度為110℃時基線平穩(wěn)，峰形較好。由于該實驗在進(jìn)行梯度洗脫時有機(jī)相的起始濃度較低，為保證高水相流動相的蒸發(fā)，該實驗最終選擇110℃的漂移管溫度。

2.2.2 霧化氣體流速的選擇 霧化氣體流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響ELSD的響應(yīng)［19］。該試驗用空氣作為載氣，在漂移管溫度為110℃和不分流模式下，考察了 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0L/min的不同流速水平，結(jié)果表明，當(dāng)流速較低時，背景噪聲較大，基線不穩(wěn)定，隨著流速的增加，信噪比升高，當(dāng)流速為2.8L/min時基線趨于平穩(wěn)，黑茶中各組分的響應(yīng)值較好，在此基礎(chǔ)上再繼續(xù)增大流速時響應(yīng)值逐漸降低，這是由于流速過大時氣溶膠液滴變小，造成信號響應(yīng)值的下降。

2.3 我國黑茶HPLC－DAD和HPLC－ELSD指紋圖譜的建立

測定了我國6個黑茶主產(chǎn)地的18個不同廠家的36個黑茶樣品，所得的HPLC－DAD指紋圖譜見圖3，HPLC－ELSD指紋圖譜見圖4。分別計算36個黑茶樣品的HPLC－DAD和HPLC－ELSD圖譜中各組分峰的相對保留時間。將各組分峰按相對保留時間一一匹配后36個黑茶樣品的HPLC－DAD色譜圖中共確定27個共有峰，各共有峰的平均相對保留時間見表2;36個黑茶樣品的HPLC－ELSD色譜圖中共確定15個共有峰，各共有峰的平均相對保留時間見表3。HPLC－DAD 指紋圖譜共有模式中的5、10、11、13、14、15、16、19號共有峰經(jīng)與對照品(圖5)比較，分別確定為沒食子酸(tR=13.447min)、表沒食子兒茶素(EGC)(tR=24.720min)、兒茶素 (C)(tR=24.933min)、咖啡因(tR=29.517min)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)(tR=31.633min)、表兒茶素(EC)(tR=33.848min)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)(tR=35.005min)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)(tR=36.585min);HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式中的2、3、5、8、9、10 號共有峰經(jīng)與對照品(圖 6)比較，分別確定為谷氨酸(tR=3.549min)、L－茶氨酸(tR=7.935min)、沒食子酸(tR=13.543min)、EGC(tR=24.818min)、EC(tR=33.946min)、ECG(tR=36.683min)。兒茶素(C)、EGCG、GCG在云南黑茶中含量很低，因此用ELSD在云南黑茶中基本檢測不到上述成分，故在建立我國黑茶的HPLC－ELSD指紋圖譜時將其剔除;咖啡因?qū)儆诎霌]發(fā)性物質(zhì)，有較強(qiáng)的紫外吸收，由于該試驗采用的ELSD漂移管溫度較高，空氣流量較大，咖啡因在該試驗條件下在ELSD中無響應(yīng)。L－茶氨酸又稱N－乙基－γ－L－谷氨酰胺，為茶屬植物中的特征性非蛋白質(zhì)氨基酸［20］;谷氨酸也是茶葉中含量較大的氨基酸［21］，這兩種組分僅在ELSD中有響應(yīng)。各黑茶樣品的色譜圖中共有峰面積占總峰面積的比例均在90%以上。

圖3 我國不同產(chǎn)地黑茶的HPLC－DAD指紋圖譜Fig.3 The HPLC－DAD fingerprinting of dark teas from different regions in China

圖4 我國不同產(chǎn)地黑茶的HPLC－ELSD指紋圖譜Fig.4 The HPLC－ELSD fingerprinting of dark teas from different regions in China

圖5 混合對照品的HPLC－DAD圖譜Fig.5 The HPLC－DAD chromatogram of mixed reference substances

圖6 混合對照品的HPLC－ELSD圖譜Fig.6 The HPLC－ELSD chromatogram of mixed reference substances

表2 我國不同產(chǎn)地黑茶樣品HPLC－DAD共有峰的平均相對保留時間Table 2 The average relative retention time of HPLC－DAD common peaks of dark teas from different regions in China

表3 我國不同產(chǎn)地黑茶樣品HPLC－ELSD共有峰的平均相對保留時間Table 3 The average relative retention time of HPLC－ELSD common peaks of dark teas from different regions in China

2.4 同源峰分析

由同一化合物激發(fā)的、分別展示在 DAD和ELSD圖譜中的一對色譜峰稱為同源峰［22］，黑茶中的一些化合物能同時激發(fā)DAD和ELSD響應(yīng)，但由于柱洗脫液是先后流入DAD和ELSD，因此同一化合物的保留時間在ELSD中會有一定的滯后，但同源峰保留時間的差值僅與兩檢測器間管路的死體積及流動相流速有關(guān)，可據(jù)此進(jìn)行同源峰的識別。取沒食子酸對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定結(jié)果表明同源峰保留時間的滯后值為0.096±0.002min，考察黑茶樣品HPLCDAD和HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式中各共有峰的保留時間，共識別出8對同源峰，見表4。

表4 黑茶樣品中的同源峰Table 4 The peaks of the same chemical compound of dark tea samples

2.5 相似度評價

應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)軟件分別計算36個黑茶樣品及對照茶樣的HPLC－DAD和HPLC－ELSD圖譜與各自指紋圖譜共有模式的相似度，見表5。結(jié)果表明，36個黑茶樣品與黑茶HPLC－DAD指紋圖譜共有模式的相似度在0.903～0.979之間，與黑茶HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式的相似度在0.902～0.974之間，相似度均大于0.900，說明它們所含的化學(xué)成分較相似。6個對照茶樣與黑茶HPLC－DAD指紋圖譜共有模式的相似度在0.545～0.835之間，與黑茶 HPLC－ELSD指紋圖譜共有模式的相似度在0.595～0.849之間，相似度較低;從圖7和圖8也可以看出黑茶與其它6個對照茶樣的譜圖有明顯差異。滇紅屬于全發(fā)酵茶，與黑茶較接近，從相似度結(jié)果可以看出，相比于其它對照茶樣，滇紅與黑茶指紋圖譜共有模式的相似度最高。

圖7 黑茶與對照茶樣的HPLC－DAD色譜圖Fig.7 The HPLC－DAD chromatogram of dark tea and the control tea samples

3 結(jié)論

圖8 黑茶與對照茶樣的HPLC－ELSD色譜圖Fig.8 The HPLC－ELSD chromatogram of dark tea and the control tea samples

該實驗利用HPLC－DAD－ELSD聯(lián)用技術(shù)建立了我國不同產(chǎn)地黑茶的HPLC－DAD－ELSD指紋圖譜，36個黑茶樣品的HPLC－DAD色譜圖中共確定27個共有峰，鑒別了8種組分，參照峰為咖啡因;HPLCELSD色譜圖中共確定15個共有峰，鑒別了6種組分，參照峰為ECG。該試驗利用DAD和ELSD分別獲取了互不相像的圖譜，說明兩者可提供不同的、互補(bǔ)的信息;黑茶中的一些化合物可同時被DAD和ELSD檢測到，產(chǎn)生一對同源峰，該試驗共識別出8對同源峰;相似度分析結(jié)果表明我國不同產(chǎn)地黑茶樣品間主要色譜峰的整體圖貌基本一致。該試驗所建立的黑茶HPLC－DAD－ELSD指紋圖譜更全面地反映了我國黑茶中非揮發(fā)性成分的化學(xué)特征，能為我國黑茶的鑒別和質(zhì)量評價提供有益參考。

表5 不同茶樣與黑茶指紋圖譜共有模式的相似度分析Table 5 Similarity analysis between different tea samples and the fingerprinting common pattern of dark teas

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