王岱杰，周曉晶，王尉，于金倩，王曉，李強(qiáng)，耿巖玲* ，Dan Staerk

(1.山東省分析測(cè)試中心，山東濟(jì)南250014;2.北京理化分析測(cè)試中心，北京100089)

甘草是我國(guó)常用大宗藥材，為豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛以及調(diào)和諸藥之功效。它用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒和緩解藥物毒性、烈性［1］。甘草具有抗寒、耐熱、耐旱以及抗鹽堿等優(yōu)良特性，適生性和抗逆性強(qiáng)，生命力旺盛，為我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)重要的植物資源之一。甘草酸(glycyrrhizic acid)又名甘草甜素(結(jié)構(gòu)式見圖1)，屬于三萜類化合物，是甘草中重要的化學(xué)成分，也是藥典中規(guī)定的甘草、炙甘草、甘草流浸膏和甘草浸膏質(zhì)量控制的重要指標(biāo)［2－3］。甘草酸具有抗病毒、鎮(zhèn)咳祛痰、抗炎和保肝等功效［4－14］，其甜度高(甜度為蔗糖的200～300倍)、熱能低且安全無毒，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化妝品和煙草等行業(yè)。截至目前，我國(guó)尚無甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，市場(chǎng)上銷售的甘草酸對(duì)照品純度也參差不齊。因此，為了滿足藥材及成藥分析檢測(cè)及質(zhì)量控制工作的需求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，本文制備了甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。

圖1 甘草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of glycyrrhizic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-3(瑞士BUCHI公司);SCIENTZ-10N冷凍干燥儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Agilent 6520 Q-ToF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司);UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian公司);Agilent 6520 Q-ToF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Aglient公司);Vario EL III全自動(dòng)元素分析儀(德國(guó)ELEMENTAR公司)。

1.2 原料與試劑

柱色譜用硅膠、薄層色譜用硅膠GF254板(青島海洋化工廠);HPLC用乙腈、甲醇為色譜純(美國(guó)天地公司);乙酸乙酯、丁酮、甲酸、氯仿、甲醇、鹽酸等均為分析純(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司);水為去離子水;10%甘草酸提取物(甘肅泛植生物科技有限公司)。

1.3 樣品制備

質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甘草酸提取物水溶解，稀鹽酸調(diào)pH值至2.0，過濾沉淀，室溫晾。硅膠柱色譜進(jìn)行分離，氯仿/甲醇梯度洗脫，分部收集甘草酸組分，薄層色譜跟蹤監(jiān)測(cè)。較純組分放置于通風(fēng)櫥內(nèi)，乙醇重結(jié)晶，過濾并干燥。

1.4 純度分析方法

等度HPLC分析條件:C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈-0.5%乙酸水溶液(38:62，V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;運(yùn)行時(shí)間:30 min;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm。

梯度HPLC分析條件:C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:A為乙腈，B為0.5%乙酸水溶液;梯度洗脫:0～20 min，38%A;20 ～40 min，38%A ～100%A;40 ～50 min，100%A;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;運(yùn)行時(shí)間:50 min;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm。

薄層色譜條件:乙酸乙酯-水-甲酸(6:1:1，V/V)和氯仿-甲醇-甲酸(4:1:1，V/V)，熒光檢測(cè)和硫酸乙醇顯色劑檢測(cè)。

MS條件:ESI電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓4.0 kV;載氣:普氮;載氣流速:10 L/min;載氣溫度:300℃，掃描范圍為m/z=100～1000。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

采用UV、IR、MS和NMR等方法對(duì)甘草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.6 均勻性檢驗(yàn)

1.7 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

考察兩周內(nèi)甘草酸樣品甲醇、乙腈兩種溶劑的穩(wěn)定性。甘草酸樣品于2～8℃保存，以2年為期，對(duì)制備的甘草酸樣品每6個(gè)月取樣檢驗(yàn)，按1.4等度HPLC分析，以面積百分比讀取樣品的純度值，每份試樣以測(cè)定5次的平均值為其定值結(jié)果，用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［15］。

1.8 定值

按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作實(shí)驗(yàn)定值，參加實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目為8個(gè)［15－18］。隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，每瓶平行測(cè)定2次。定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，高效液相色譜儀測(cè)定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 純度分析

分別采用等度和梯度HPLC對(duì)甘草酸樣品進(jìn)行洗脫，DAD檢測(cè)器進(jìn)行3D掃描，扣除溶劑峰，掃描色譜圖未見明顯雜質(zhì)色譜峰。237 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，對(duì)甘草酸樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一化定量，扣除溶劑峰，等度和梯度HPLC純度分別為99.32%和99.35%。從薄層色譜圖看，乙酸乙酯-水-甲酸(6:1:1，V/V)和氯仿-甲醇-甲酸(4:1:1，V/V)展開體系的Rf值分別為0.85和0.64，熒光檢測(cè)和硫酸乙醇顯色劑檢測(cè)未見明顯雜質(zhì)。通過考察甘草酸正離子模式和負(fù)離子模式的總離子流圖，未見明顯雜質(zhì)峰。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

采用UV，IR，MS和NMR 等方法對(duì)甘草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，數(shù)據(jù)如下。UV λEtOHmax:237.2 nm;IR υcm－1max:3 398(νOH)，2 949(νCH)，1 715(νC=O)，1 656(νC=C)，1 455，1 370(νCH)，1 080，1 045(νCO);ESI-MS:m/z 823.412 0［M+H］+，845.393 2［M+Na］+，821.387 3［M －H］－。1H 和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1、表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］比較，確定為甘草酸(Glycyrrhizic acid)。

表1 甘草酸的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)(氘代溶劑DMSO-d6)Table 1 The1H-NMR data of glycyrrhizic acid(DMSO-d6)

表2 甘草酸的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(氘代溶劑DMSO-d6)Table 2 The13C-NMR data of glycyrrhizic acid(DMSO-d6)13C

2.3 均勻性檢驗(yàn)

以F檢驗(yàn)，確定甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否附合正態(tài)分布。其結(jié)果見表3～5。

表3 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果(%)Table 3 Homogeneity test result(%)

表4 每瓶的平均值、方差和測(cè)量次數(shù)Table 4 Mean value，variance and measurement numbers for every bottle

表5 均勻性研究的方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of homogeneity test

瓶間方差用下式計(jì)算

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差為

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可由MSwithin計(jì)算

均勻性引入的不確定度為

從表5可見，以 υ1(即組間)=9及 υ2(即組內(nèi))=20查 F界值表，得 F0.05(9，20)=2.94，由于F=MS間/MS內(nèi)=1.41＜F0.05(9，20)，因此研制的甘草酸標(biāo)樣樣品是均勻的。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察斜率值是否有顯著變化，以此對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 Stability test result

斜率按下式計(jì)算

截距由下式計(jì)算

直線上的點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由下式計(jì)算

則s=0.03%，與斜率相關(guān)的不確定度用下式計(jì)算

自由度為n－2和p=0.95(95% 置信水平)的分布t因子為

由于

即|b1|＜0.006 4%，因此斜率的變化不顯著，即甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在2年內(nèi)未觀測(cè)到明顯的不穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性的不確定度。

2.5 定值

根據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得全部測(cè)定結(jié)果，計(jì)算出甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值。定值結(jié)果見表7。

根據(jù)表7數(shù)據(jù)計(jì)算測(cè)定結(jié)果的總平均值

表7 甘草酸純度定值結(jié)果及不確定度(%)Table 7 Purity certification results of glycyrrhizic acid and its uncertainty(%)

實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差

總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

多家定值引入的不確定度

研制的標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度由以下幾部分組成:

(1)均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度;

(2)穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度;

(3)多家定值引入的不確定度。

各不確定度分量互不相關(guān)，因此合成不確定度

代入數(shù)據(jù)計(jì)算得u=0.005 9%。

置信區(qū)間95% 時(shí)，k=2，則擴(kuò)展不確定度U=2 u=0.005 9% ×2=0.12%。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)甘草酸缺乏國(guó)家實(shí)物標(biāo)樣的現(xiàn)狀，進(jìn)行了甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。根據(jù)GB/T15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，對(duì)制備的樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性及定值研究。制備出標(biāo)準(zhǔn)值為99.29%、擴(kuò)展不確定度(95%置信區(qū)間)為0.12%的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立了甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)規(guī)范要求，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域的研究空白。該標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制可滿足甘草藥材及成藥分析檢測(cè)、質(zhì)量控制工作的需求，為其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性提供技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:80－81.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:81.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:376.

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