王曉煒，宋波，姜云清，馬曉凱

(1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實驗室，遼寧大連116044;2.大連市結(jié)核病醫(yī)院檢驗科，遼寧大連116033)

射干(Belamcanda chinensis(L.)DC.)又叫蝴蝶花，為鳶尾科射干屬多年生草本植物［1－2］，生長于山坡或草地，在我國的吉林、遼寧、西藏、安徽、臺灣和云南等地均有分布［3］。射干的根莖和根含鳶尾苷元及射干醛等藥用成分［4］，中醫(yī)以射干的根莖作為藥用部分，具有消瘀散結(jié)、祛痰利咽和清熱解毒等功效，能治療咽喉腫痛、咳嗽痰多、癰腫瘡毒、痰壅咳喘以及乳腺炎等疾?。?－5］。射干不僅具有多種人用中藥價值，而且其干粉添加在飼料中，定期喂食家畜和家禽，還能減少發(fā)病率，降低養(yǎng)殖費用。遼寧南部的部分地區(qū)，如長海、丹東、桓仁等地每年都要大量地采收射干根莖出售、藥用或做飼料添加成分，使射干的野生資源遭到嚴重破壞。過去在遼寧南部有射干分布的地區(qū)，現(xiàn)已很難看到或采到射干。

目前已有鳶尾科植物組織培養(yǎng)研究的報道［6－7］，以及射干幼嫩葉片、莖尖和假莖愈傷組織培養(yǎng)［8－9］和射干試管苗根莖誘導(dǎo)研究的［10］相關(guān)文獻，但射干幼莖愈傷組織及試管苗培養(yǎng)研究的相關(guān)研究未見報道。為保護射干的野生資源，本文對其進行了幼莖愈傷組織及試管苗培養(yǎng)的研究。

1 材料及方法

1.1 材料

選取6月上旬大連英歌石山坡上生長高度為2～3 cm的射干幼莖為本研究材料。

1.2 處理方法

每天1次、連續(xù)4 d向植株的表面噴灑濃度為2.5 mg·L－1的慶大霉素溶液，同時也將根部澆透相同的溶液。在第5 d將包括葉片在內(nèi)的植株地上部分采回實驗室后剝掉葉片，將幼莖放到200～250 mL的磨口廣口瓶中，在無菌環(huán)境中用70%乙醇與0.25 mg·L－1HgCl3的混合滅菌溶液搖晃滅菌10 min后，用無菌水洗滌7次，即可獲得作為實驗材料的射干無菌幼莖。處理方法參見李慧等的研究［11］。

1.3 實驗方法

1.3.1 幼莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

在超凈臺上，用手術(shù)刀將無菌幼莖切成長約0.4 cm的幼莖段，再用槍狀鑷子將幼莖段橫半插入愈傷組織培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中。愈傷組織培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基是附加瓊脂5.3 g·L－1、蔗糖38 g·L－1的MS為基本培養(yǎng)基，并采用不同濃度的人工生長素2，4-D和人工細胞分裂素6-BA的正交試驗?zāi)Ｊ?，進行2，4-D和6-BA對幼莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響實驗。重復(fù)2次，每種培養(yǎng)基接種45個形態(tài)與大小幾乎一致的幼莖段。

1.3.2 幼莖段愈傷組織分化培養(yǎng)

把在 MS+瓊脂5.3 g·L－1+蔗糖38 g·L－1+2，4-D 2.2 mg·L－1+ZT 0.8 mg·L－1培養(yǎng)基上培養(yǎng)63 d的嫩綠色愈傷組織，用接種鏟分切成0.3 cm左右的塊狀，接種到以附加瓊脂5.3 g·L－1、蔗糖42 g·L－1和NAA 0.05 mg·L－1的1/2MS 為基本培養(yǎng)基，再附加濃度分別為 0、0.7、1.4、2.1、2.8 mg·L－1的細胞分裂素KT、ZT、6-BA的培養(yǎng)基上，放到光照強度250 Lx(以下簡稱弱光照)和4 000 Lx(以下簡稱強光照)的不同光照條件下培養(yǎng)，進行不同光照條件、不同濃度細胞分裂素對愈傷組織分化生長的影響實驗。實驗重復(fù)3次，各種處理條件均接種40塊愈傷組織。

1.3.3 無根苗生根培養(yǎng)

把在1/2MS+瓊脂 5.3 g·L－1+蔗糖 42 g·L－1+NAA 0.05 mg·L－1+6-BA 1.4 mg·L－1培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長的無根苗從愈傷組織塊上剪下，把下部剪口插到以1/4MS+蔗糖10 g·L－1+瓊脂5.3 g·L－1+IBA 0.05 mg·L－1為基本培養(yǎng)基、附加濃度分別為 0.25、0.50、0.75、1.0 mg·L－1的 ABT2 號、2，4-D、NAA 和 IAA 4種生根劑的培養(yǎng)基上，進行不同種類、不同濃度生根劑對試管苗培養(yǎng)的影響實驗。實驗重復(fù)了3次，每次實驗每種培養(yǎng)基都以60個無根苗為材料。

1.3.4 煉苗、移栽與定植

把在1/4MS+蔗糖10 g·L－1+瓊脂5.3 g·L－1+IBA 0.05 mg·L－1+IAA 0.25mg·L－1培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～30 d、生長旺盛的試管苗培養(yǎng)瓶瓶口敞開，在光照強度4 500 Lx左右的溫室中煉苗3～4 d，移栽到上層為5～8 cm厚河沙的營養(yǎng)缽中。共進行了3次移栽試驗，移栽的試管苗分別為54、57和54株。

把在營養(yǎng)缽中移栽的149株成活苗，6月12日一次性定植到大連旅順英歌石山坡上。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人工生長調(diào)節(jié)劑2，4-D和6-BA對幼莖段愈傷組織生長的影響

幼莖段培養(yǎng)至第63 d時的觀察結(jié)果由表1顯示。培養(yǎng)基中加入了濃度為2.4 和3.2 mg·L－1的6-BA 與濃度為1.1、2.2 和3.3 mg·L－1的2，4-D 配合使用時，愈傷組織均不能生長;而在濃度為0.8和1.6 mg·L－16-BA，分別與濃度為1.1、2.2和3.3 mg·L－1的2，4-D配合使用時，培養(yǎng)的幼莖段都能誘導(dǎo)生長出愈傷組織，其誘導(dǎo)生長率分別為37.8%、91.1%和71.1%。從誘導(dǎo)率和愈傷組織的長勢這 2項指標上看，在 2，4-D的濃度為 2.2 mg·L－1、6-BA的濃度為0.8 mg·L－1組合的培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織誘導(dǎo)率達到91.1%，而且外觀長勢較好。對整個培養(yǎng)過程中的觀察還證明，在2，4-D的濃度為2.2 mg·L－1、6-BA的濃度為0.8 mg·L－1的人工生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長時間較早，在第9 d就能看到有的培養(yǎng)幼莖段切口處誘導(dǎo)生長出愈傷組織;在20～50 d期間愈傷組織生長速度最快;培養(yǎng)到60 d時，誘導(dǎo)生長出愈傷組織的幼莖段就會形成由很多直徑為0.15～0.32 cm的顆粒組成、平均直徑為2.1 cm的半球形綠色愈傷組織(見圖1)。重復(fù)實驗與初次實驗的結(jié)果一致。以上培養(yǎng)結(jié)果說明，2，4-D的濃度為2.2 mg·L－1、6-BA的濃度為0.8 mg·L－1的生長調(diào)節(jié)劑組合適宜于射干幼莖段愈傷組織的培養(yǎng)，射干幼莖段培養(yǎng)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基是 MS+瓊脂5.3 g·L－1+蔗糖38 g·L－1+2，4-D 2.2 mg·L－1+6-BA 0.8 mg·L－1。

圖1 由嫩莖誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織Fig.1 The callus induced by tender stem culture

表1 不同濃度人工生長調(diào)節(jié)劑2，4-D和6-BA對幼莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響Table 1 Impacts of different concentrations artificial growth regulators，2，4-D and 6-BA，on callus culture of the younger stems

2.2 不同光照條件、不同濃度細胞分裂素對塊狀愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)至56 d時統(tǒng)計結(jié)果證明，弱光條件下培養(yǎng)的愈傷組織不分化，而在強光條件下，培養(yǎng)基中加入了KT、ZT 2種不同濃度細胞分裂素，培養(yǎng)的愈傷組織也不分化。只有在強光條件下、培養(yǎng)基中加入了6-BA這一細胞分裂素的條件下，培養(yǎng)的愈傷組織才能分化。由表2可見，4種6-BA濃度條件下，培養(yǎng)的愈傷組織塊都能分化。其中在濃度為1.4 mg·L－16-BA培養(yǎng)基上，愈傷組織塊分化效果最好。不僅分化生長的無根苗長勢旺盛，而且分化率最高(92.5%)、無根苗平均高度最高(1.6 cm)。觀察還證明，在6-BA濃度為1.4 mg·L－1的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到11 d時在嫩綠色愈傷組織塊的上部就分化生長出可見無根苗，并且隨著培養(yǎng)期延長，分化的無根苗數(shù)不斷地增加。培養(yǎng)到50～56 d時，每塊培養(yǎng)的愈傷組織均會分化生長出多個無根苗，外觀上出現(xiàn)每塊愈傷組織上生長著一叢無根苗的狀態(tài)。3次重復(fù)實驗的結(jié)果幾近一致。由此說明，濃度為1.4 mg·L－1的6-BA適于射干幼莖段愈傷組織的分化培養(yǎng)，射干幼莖段愈傷組織分化無根苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是 1/2MS+瓊脂5.3 g·L－1+蔗糖42 g·L－1+NAA 0.05 mg·L－1+6-BA 1.4 mg·L－1。

表2 不同濃度6-BA對塊狀愈傷組織分化無根苗培養(yǎng)的影響Table 2 Impacts of different concentrations 6-BA on rootless seedling culture of block callus differentiation

2.3 不同生根劑對試管苗培養(yǎng)的影響

3次無根苗的生根實驗都培養(yǎng)至30 d時統(tǒng)計的結(jié)果顯示，在附加不同濃度ABT2號、2，4-D、NAA 3種生根劑的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)的無根苗均不生根。而在附加IAA這種生根劑的培養(yǎng)基上，4種濃度的處理均可不同程度地生根生長為試管苗(見表3)。由表3可見，在附加濃度為0.25 mg·L－1的培養(yǎng)基上生根效果最好。3次實驗接種培養(yǎng)的180個無根苗，生根生長為試管苗的為165株，其生根率為91.7%，每株試管苗平均生根5.3條、株高3.6 cm。與其他3種濃度的培養(yǎng)基相比，在這種濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的試管苗的長勢也是最旺盛的。以上結(jié)果證明，射干幼莖段愈傷組織分化無根苗生根培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是1/4MS+蔗糖10 g·L－1+瓊脂 5.3 g·L－1+IBA 0.05 mg·L－1+IAA 0.25 mg·L－1。

表3 不同濃度IAA對無根苗生根培養(yǎng)的影響實驗(3次實驗平均結(jié)果)Table 3 Impacts of different concentrations IAA on rootless growth and test-tube seedling culture

2.4 生根苗的移栽與定植

3次共移栽165株，成活149株，成活率為90.3%。

定植后48 d統(tǒng)計觀察，成活了143株，定植成活率為96.0%。定植成活的試管苗與野生的射干植株相比，除了當年表現(xiàn)為植株整齊、葉色更綠外，其他植物學(xué)性狀與野生植株無不同。第二年8月中旬開花，9月中旬結(jié)果。

3 討論

目前已有的以植物幼莖為材料進行組織培養(yǎng)研究的報道［12－13］，其研究結(jié)果大都限于誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織。本研究以射干幼莖為材料，不僅成功地誘導(dǎo)并培養(yǎng)了嫩綠色的愈傷組織，而且分化培養(yǎng)出無根苗，并培養(yǎng)出射干試管苗。幼莖較易誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織并生長出正常的試管苗，這不僅與本研究探索出較理想的培養(yǎng)基及培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)，而且也與幼莖本身正處于分化狀態(tài)，具有較多的分生細胞有關(guān)。

在本研究中，定植于大連旅順英歌石山坡上的射干試管苗完全保持了野生射干的植物學(xué)性狀也證明，由幼莖愈傷組織培養(yǎng)的試管苗，可作為射干野生資源保護的一條有效途徑，也為射干的人工藥用栽培的種苗提供了新來源。

本研究顯示，在植物組織培養(yǎng)研究中，對愈傷誘導(dǎo)、分化和生根的影響因素，除了光照、溫度等環(huán)境因素外，能否達到理想的研究結(jié)果，重要的影響因素是培養(yǎng)基，而其中最重要的是生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比。本文的研究結(jié)果與前人的研究基本一致［14］。

在本研究中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖含量為蔗糖38 g·L－1，愈傷組織分化培養(yǎng)基的蔗糖含量為42 g·L－1，而試管苗培養(yǎng)的蔗糖含量為10 g·L－1。誘導(dǎo)培養(yǎng)和分化培養(yǎng)的材料本身沒有可以大量吸收營養(yǎng)的器官根系，只能依賴于從接觸與材料的培養(yǎng)基上吸收一部分蔗糖，加之材料自身光合作用也較差，因此培養(yǎng)中必須加入較高濃度的蔗糖。相反，把無根苗培養(yǎng)成試管苗，不僅試管苗本身具有根系能吸收大量的蔗糖等營養(yǎng)，而且培養(yǎng)初期使無根苗處于饑餓狀態(tài)更有利于使其生根生長為試管苗。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志第十六卷第一分冊［M］.北京:科學(xué)出版社，1985:131－133.

［2］中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒第五冊［M］.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1983:570－570.

［3］李書心.遼寧植物志下冊［M］.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1991:772－773.

［4］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典下冊［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:2657－2660.

［5］馮景剛，顏廷林.遼寧常見中草藥圖說［M］.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2013:208－209.

［6］廖林楠，孫萍，徐香玲.唐菖蒲組織培養(yǎng)初探［J］.哈爾濱師范大學(xué):自然科學(xué)學(xué)報，2005，21(2):84－86.

［7］劉孟穎，高洋，于世達，等.馬藺的組織培養(yǎng)及無性系建立研究［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(6):4－6.

［8］張慧英，薛延軍，張耀華，等.射干葉片愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究［J］.中藥材，2010，33(2):176－178.

［9］方緒鳳.道地藥材射干愈傷組織誘導(dǎo)及其分化的研究［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2007.

［10］張耀華，張慧英，薛艷霞.射干試管苗根莖誘導(dǎo)研究［J］.中草藥，2008，39(6):910－913.

［11］李慧，夏鴻飛，王曉旭，等.皺葉酸模愈傷組織培養(yǎng)及大黃素的分析［J］.延邊大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，38(4):296－300.

［12］曹彬，孫占育，張德倉.大葉黃楊幼莖愈傷組織誘導(dǎo)的研究初報［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24(8):131－135.

［13］李琰，張朝紅，崔宏安.激素對杜仲幼莖愈傷組織誘導(dǎo)及生長的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，32(1):57－60.

［14］安利佳，姜長陽.植物組織培養(yǎng)導(dǎo)論［M］.大連:遼寧師范大學(xué)出版社，1996:43－52.