李 妍，李 鋒，許 暉

(1.蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系，安徽 蚌埠 233030;2.南京軍區(qū)總醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 210002)

荷葉系睡蓮科蓮屬植物蓮NeLumbo nuciferaGaertn的干燥葉[1].相關(guān)研究表明，荷葉內(nèi)的黃酮具有調(diào)血脂活性，其減肥降脂作用越來越受到人們的重視[2].黃酮類物質(zhì)具有抗病毒、抗菌、抑制癌細(xì)胞等多種藥理活性，對(duì)治療心血管等疾病有重要意義[3].然而，多數(shù)黃酮類物質(zhì)均存在難溶于冷水且不穩(wěn)定的問題，這就使其應(yīng)用受到限制.微囊化技術(shù)改變了物態(tài)、體積和質(zhì)量;降低了揮發(fā)性并進(jìn)行控制性釋放;隔離活性成分，保護(hù)敏感物質(zhì)[4-7].本實(shí)驗(yàn)采用啤酒酵母細(xì)胞對(duì)荷葉總黃酮進(jìn)行包埋，實(shí)現(xiàn)其微膠囊化.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉采自蚌埠市懷遠(yuǎn)縣;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定所);95%乙醇(上海振企化學(xué)試劑有限公司);酵母浸粉(北京索萊寶科技有限公司);蒸餾水(蚌埠學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制造);蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、硫酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

722 可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);FA214 電子天平(上海衡器總廠);XFB-200 高速中藥粉碎機(jī)(吉首市中誠制藥機(jī)械廠);725N 紫外可見光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);HH-1 恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市榮華儀器有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海一恒科學(xué)儀器有限公司);離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司);THZ-103B 恒溫震蕩培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司);SB-25-12DT 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8，9]

采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH 顯色法.即準(zhǔn)確稱取20 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑，用50%乙醇溶液定溶至100 mL，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液;準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL 于8只25 mL 容量瓶中，然后分別加入1 mL 5% NaNO2，放置6 min，加入1 mL 10% Al (NO3)3，搖勻，放置6 min，加入10 mL 4% NaoH 50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min 后，在510 nm 處測定其吸光度.以吸光度A 對(duì)蘆丁濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2 包埋率的計(jì)算法[10]

準(zhǔn)確稱取荷葉總黃酮的量為M.由于不能直接對(duì)包埋的荷葉總黃酮進(jìn)行測定，故可以通過測定未被包埋的荷葉總黃酮的含量(X)，間接換算出被包埋的荷葉總黃酮的量(M-X).則包埋率為:(M-X)/M.X的測定方法為:將包埋后的懸液測定其在510 nm處的吸光度，再將吸光度代入荷葉總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算出荷葉總黃酮的含量，即為X.

1.3.3 荷葉總黃酮的提取

稱取荷葉1 g，采用80%乙醇濃度，調(diào)節(jié)pH值為9，超聲提取時(shí)間45 min，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，真空干燥24 h[2].

1.3.4 荷葉總黃酮微膠囊的制備

酵母細(xì)胞經(jīng)過5次水洗過后，加20倍的5%氯化鈉溶液，置于錐形瓶中，放入54℃，150 r/min 搖床中進(jìn)行質(zhì)壁分離24 h，再次4 200 r/min 離心10 min，經(jīng)5次水洗后，放置-80℃冰箱中冷凍2 h，最后放在冷凍干燥機(jī)上干燥24 h.

將荷葉總黃酮和酵母細(xì)胞按不同的芯材比加入錐形瓶中，并加入一定體積的蒸餾水，混合均勻后，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中.恒溫恒速振蕩一定時(shí)間后，利用滲透擴(kuò)散作用使荷葉總黃酮可進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)部，從而形成微膠囊.混合溶液在4 200 r/min 離心10 min后，將上層清液緩慢倒出，下層細(xì)胞用蒸餾水洗滌，將未包入的荷葉總黃酮除去，冷凍干燥24 h 后，得包埋物.

1.3.5 包埋單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 包埋時(shí)間對(duì)包埋效果的影響

準(zhǔn)確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將料液比確定為1∶6，芯材比為1∶3，溫度為40℃，包埋時(shí)間分別設(shè)為4、5、6、7、8 h.平行3次，按照1.3.4 操作，制備微膠囊.

1.3.5.2 料液比對(duì)包埋效果的影響

準(zhǔn)確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時(shí)間確定為6 h，芯材比為1∶3，溫度為40℃，料液比分別設(shè)為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8.平行3次，按照1.3.4操作，制備微膠囊.

1.3.5.3 芯材比對(duì)包埋效果的影響

準(zhǔn)確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時(shí)間確定為6 h，料液比為1∶6 溫度為40℃，芯材比分別設(shè)為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5.平行3次，按照1.3.4操作，制備微膠囊.

1.3.5.4 溫度對(duì)包埋效果的影響

準(zhǔn)確稱取荷葉總黃酮1.00 g，將包埋時(shí)間確定為6 h，料液比為1∶6，芯材比為13 溫度分別設(shè)為20、30、40、50、60℃.平行3次，按照1.3.4 操作，制備微膠囊.

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表.研究包埋時(shí)間 (A)、料液比 (B)、芯材比 (C)和溫度(D)4個(gè)因素對(duì)荷葉總黃酮微膠囊制備的影響.正交因素水平表見表2-1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x ±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷采用單因素方差分析[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在波長510 nm 處，測定不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在顯色反應(yīng)后的吸光度值，結(jié)果見圖1.由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A =16.61C-0.0028，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，表明二者線性關(guān)系良好[10].

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 包埋時(shí)間對(duì)包埋效果的影響

由圖2可知，隨著包埋時(shí)間的延長，荷葉總黃酮的包埋率先增加后減小，在包埋時(shí)間6 h 處出現(xiàn)最高點(diǎn).包埋率并未隨時(shí)間的增加而增加，可能是由于過長時(shí)間的振蕩，反而阻止微膠囊的形成，而且對(duì)荷葉總黃酮微膠囊產(chǎn)生破壞作用.

2.2.2 料液比對(duì)包埋效果的影響

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3可知，在料液比為1∶7 包埋率隨著料液比的增大而增加，之后料液比增加包埋率反而下降.這種現(xiàn)象表明，過多的溶劑對(duì)荷葉總黃酮微膠囊的形成并非有利，反而影響了包埋的效果.

2.2.3 芯材比對(duì)包埋效果的影響

由圖4知，在被包埋物質(zhì)量不變的情況下，不斷地加大壁材酵母細(xì)胞的質(zhì)量，包埋率先穩(wěn)定上升后緩慢下降.造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于隨著壁材的增多，壁材分子之間相互作用，降低了壁材對(duì)包埋物的包埋效果，從而導(dǎo)致了包埋率的降低.

圖2 包埋時(shí)間對(duì)包埋效果的影響

圖3 料液比對(duì)包埋效果的影響

2.2.4 溫度對(duì)包埋效果的影響

圖4 芯材比對(duì)包埋效果的影響

由圖3-4可知荷葉總黃酮微膠囊的包埋率隨著溫度的升高先升高后降低，在50℃處出現(xiàn)最高峰.這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子結(jié)構(gòu)遭到破壞了或是水分蒸發(fā)速度太快，導(dǎo)致壁材成膜性降低.結(jié)果表明包埋溫度并不是越高越好，而是只有在合適的溫度下包埋效率可達(dá)到最高，微膠囊效果最好

圖5 溫度對(duì)包埋效果的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

由表2、表3可以得出，各因素的主次為D ＞A ＞B ＞C，最佳組合為A2B2C1D2.即影響荷葉總黃酮微膠囊化的主要因素為:溫度＞包埋時(shí)間＞料液比＞芯材比.荷葉總黃酮包埋的最佳條件為:包埋時(shí)間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃，包埋率可達(dá)到30.4%.

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

參考最佳微膠囊化條件:包埋時(shí)間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃，共進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得荷葉總黃酮包埋率分別為30.2%、31.1%和30.4%，平均為(30.4 ±0.17)%，因此采用此包埋優(yōu)化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用啤酒酵母細(xì)胞對(duì)荷葉總黃酮進(jìn)行包埋，最佳包埋條件為:包埋時(shí)間6 h，料液比為1∶7，芯材比為1∶2，包埋溫度為50℃.由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示在此條件下荷葉總黃酮微膠囊化的包埋率可達(dá)到30.4%.本實(shí)驗(yàn)中使用恒溫振蕩培養(yǎng)箱，通過振蕩使荷葉總黃酮微膠囊化的方法遠(yuǎn)優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道其它方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

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