崔慧霞，張文陸

（遼寧醫(yī)學院1.護理學院基護教研室；2.附屬第一醫(yī)院綜合八病區(qū)，遼寧 錦州 121001）

腫瘤生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四大治療模式。其中，樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是腫瘤生物治療研究的熱點。DC是功能最強的專職性抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC），可將抗原信息以主要組織相容性復合體（major histocompability complex，MHC）-抗原肽復合體的形式提呈給初始T淋巴細胞，從而誘導其成為特異性的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），因此DC是機體免疫反應(yīng)的始動者［1］。不成熟的DC抗原提呈能力較弱，成熟的DC才具有強大的抗原提呈能力。因此，在體外誘導培養(yǎng)的DC中常加入某些刺激劑以促進其成熟。為了促進DC對特異性抗原的提呈，在培養(yǎng)的過程中常加入抗原蛋白或編碼蛋白的腺病毒，而這2種刺激劑中的哪一種更能促進DC的成熟，已有文獻說法不一，故本研究擬比較腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負載在促進DC成熟中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮外周血來源于健康志愿者；表達人乳腺珠蛋白（mammaglobin＆x100ccf;A，MGBA）的重組腺病毒Ad＆x100ccf;MGBA和空腺病毒Ad＆x100ccf;null為本研究室構(gòu)建；人重組乳腺珠蛋白購自臺灣Abnova公司；重組人粒單核細胞集落刺激因子（granulocyte＆x100ccf;macrophage colony＆x100ccf;stimulating factor，GM＆x100ccf;CSF）、重組人腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor＆x100ccf;α，TNF＆x100ccf;α）、重組人白細胞介素4（interleukin＆x100ccf;4，IL＆x100ccf;4）均購自廈門特寶公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物技術(shù)有限公司；IL＆x100ccf;12p70ELISA檢測試劑盒購自達科為生物科技有限公司；藻紅蛋白（phycoerethrin，PE）標記的鼠抗人CD80、別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標記的鼠抗人CD83、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的鼠抗人CD86及相應(yīng)的同型對照抗體均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC的培養(yǎng)及實驗分組：從健康志愿者的外周血中，用密度梯度離心法分離單個核細胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基于37Ⅴ、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h，非貼壁細胞棄除，貼壁細胞用含1 000 IU/mL GM＆x100ccf;CSF和500 IU/mL IL＆x100ccf;4的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3日換液。將體外誘導培養(yǎng)的DC共分成4組：（1）DC組：為對照組，常規(guī)培養(yǎng)；（2）MGBAp DC組：在培養(yǎng)第4天添加40 μg/mL純化的人MGBAp；（3）Ad＆x100ccf;null DC組：在培養(yǎng)第5天按MOI200加入腺病毒空載體Ad＆x100ccf;null；（4）Ad＆x100ccf;MGBA DC組：在培養(yǎng)第5天按MOI200加入重組腺病毒Ad＆x100ccf;MGBA。

1.2.2 形態(tài)觀察：上述各組DC培養(yǎng)至第7天，用倒置相差顯微鏡觀察各組DC的形態(tài)。并收集各組DC用于后續(xù)的研究。

1.2.3 各組DC表型的檢測：收集培養(yǎng)至第7天的各組DC，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，每個EP管中加入0.5 mL細胞懸液，分別加入PE標記的CD80、APC標記的CD83、FITC標記的CD86及對應(yīng)的同型對照抗體，4避光孵育30～40 min，PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸細胞后于流式細胞儀中上機分析。

1.2.4 各組DC細胞上清中IL＆x100ccf;12的表達：檢測各組DC上清中IL＆x100ccf;12的表達，具體按ELISA試劑盒操作說明書進行。在酶標儀上檢測各組的OD值，再根據(jù)標準曲線換算出IL＆x100ccf;12的濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負載對DC形態(tài)的影響

用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)7 d的DC，結(jié)果如圖1所示：與未處理組相比，用2種腺病毒轉(zhuǎn)染組DC以及蛋白添加組DC均出現(xiàn)了典型的形態(tài)變化：細胞體積增大，外形不規(guī)則，且有典型的樹突狀突起；而未作任何處理的DC雖然體積也較以前增大，但典型的突起較少。提示腺病毒轉(zhuǎn)染及蛋白負載均能促進DC形態(tài)上的成熟。

圖1 相差顯微鏡下培養(yǎng)7 d的D C的形態(tài)特點×400

2.2 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負載對DC表型的影響

如圖2、3所示：與普通DC相比，病毒轉(zhuǎn)染組與蛋白負載組DC表面標記CD80、CD83和CD86均上調(diào)，說明腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負載均能能促進DC表型的成熟；而雖然2個病毒轉(zhuǎn)染組與蛋白負載組之間在CD86的表達上無差別，但在CD80和CD83的表達上，腺病毒轉(zhuǎn)染組，尤其是Ad＆x100ccf;MGBA DCs組均高于蛋白轉(zhuǎn)染組，說明腺病毒轉(zhuǎn)染比蛋白負載更能促進DC表型的成熟。值得注意的是，兩腺病毒轉(zhuǎn)染組，即Ad＆x100ccf;null DC組和Ad＆x100ccf;MGBA DC組間并無顯著差別。

2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負載對DC IL＆x100ccf;12分泌的影響

如圖4所示：普通DC組IL＆x100ccf;12的分泌顯著低于其他3組DC，提示病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負載DC均能有效刺激DC分泌IL＆x100ccf;12；蛋白負載與病毒轉(zhuǎn)染間雖無統(tǒng)計學差異，但從平均值上分析，腺病毒轉(zhuǎn)染組，尤其是Ad＆x100ccf;MGBA轉(zhuǎn)染組的IL＆x100ccf;12的分泌高于蛋白負載組。同DC表型結(jié)果一樣，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組之間在IL＆x100ccf;12的分泌上也無顯著差別。

圖2 腺病毒轉(zhuǎn)染對D C表型的影響

圖3 腺病毒轉(zhuǎn)染對D C表型影響的統(tǒng)計學分析

圖4 腺病毒轉(zhuǎn)染對D C IL＆x100ccf;12分泌的影響

3 討論

DC的主要功能是抗原提呈作用，可將抗原信息遞呈給T淋巴細胞并將其激活，從而啟動機體的細胞免疫。然而DC的這種功能是隨著其成熟而逐漸增強的。不成熟DC體積小，沒有或有很少的突起，此時抗原攝取能力較強，而提呈能力較弱；隨著DC的成熟，其抗原提呈能力越來越強，在形態(tài)上也出現(xiàn)了明顯的變化，表現(xiàn)為體積增大并出現(xiàn)典型的突起，即毛刺樣外觀［1，2］。DC可以從人外周血單核細胞中進行體外分離誘導培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中可加入抗原信息誘導其對特異性抗原的提呈，抗原蛋白負載DC和編碼抗原的腺病毒轉(zhuǎn)染DC是常用的2種方法［2，4］，而究竟這2種方法中的哪一種更能促進DC的成熟，目前仍有爭議，因此本研究對這2種方法進行了比較。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負載均能促進DC形態(tài)上的成熟，即均出現(xiàn)了典型的毛刺樣外觀，而未加任何處理的DC毛刺則較少（圖1）。

DC激活初始T淋巴細胞需要兩者表面共刺激分子的參與［5］。CD80、CD83和CD86是DC表面表達的主要共刺激分子，且其表達隨著DC的成熟而逐漸上調(diào)。其中，CD83被認為是DC成熟的標記分子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與普通DC組相比，2種病毒轉(zhuǎn)染DC組和蛋白負載組均促進了這3種共刺激分子的表達，且病毒轉(zhuǎn)染組在CD80和CD83的表達上要優(yōu)于蛋白負載組（圖2、3）。

IL＆x100ccf;12不僅有利于T細胞的激活，而且能促使Th細胞向Th1方向分化，從而有利于細胞免疫［6］。因此，研究中常監(jiān)測IL＆x100ccf;12的表達來判斷DC在免疫調(diào)節(jié)中的作用。本研究結(jié)果顯示，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組和蛋白負載組IL＆x100ccf;12的表達均顯著高于普通DC組，雖然統(tǒng)計上無顯著差別，但從均值上分析，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組的IL＆x100ccf;12的分泌量高于蛋白負載組。

無論是腺病毒轉(zhuǎn)染還是外來蛋白刺激，DC最終都是將蛋白裂解成小分子的多肽，再與MHC分子結(jié)合后表達在細胞表面供T細胞識別。因此，對DC而言外來的腺病毒和蛋白都是異己成分從而被其提呈并促進其成熟。但腺病毒轉(zhuǎn)染能夠在DC細胞內(nèi)表達活性的蛋白，從而持續(xù)地刺激DC，促進其對抗原的提呈，那么是腺病毒本身還是表達的活性蛋白促進了DC的成熟呢？本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染腺病毒的2組DC，尤其是表達MGBA的重組腺病毒轉(zhuǎn)染組，無論是在共刺激分子表達上還是IL＆x100ccf;12的分泌上均高于蛋白負載組，但2組腺病毒轉(zhuǎn)染組間并無統(tǒng)計學差異。回顧文獻，發(fā)現(xiàn)對于此方面的機制尚未完全闡明，有的研究認為是腺病毒本身的殼體成份——五位體刺激DC致使其成熟；也有研究認為腺病毒進入DC細胞后再進入細胞核起到了類似于轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而促進一大批分子的表達，其中就包括上述共刺激分子和IL＆x100ccf;12；在這2種機制中均是腺病毒本身的作用促進DC的成熟，而與其是否表達目的基因無關(guān)［7］?？傊?，腺病毒轉(zhuǎn)染較蛋白負載更能促進DC的成熟。

綜上所述，腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負載均能夠促進DC的成熟，能夠促進DC共刺激分子的表達，促進IL＆x100ccf;12的分泌，然而腺病毒轉(zhuǎn)染比蛋白負載更能促進DC的成熟。

［1］崔慧霞，李妍，祁馨卉，等.腺病毒轉(zhuǎn)染對樹突狀細胞成熟的影響［J］.中國醫(yī)科大學學報，2013，42（5）：412-415.

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［5］姜娜，潘蕾，李媛，等.慢性丙型肝炎患者抗病毒治療前后外周血樹突狀細胞表面共刺激分子的變化及初步分析［J］.臨床肝膽病雜志，2012，28（6）：446-449.

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