張淑芹 ，王華，梁峰

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004，2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科 遼寧 錦州 121000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121000）

癲癇是一種嚴(yán)重威脅人類健康的可致殘性疾病，約60%于兒童期發(fā)?。?］。在兒童癲癇中，經(jīng)過抗癲癇藥系統(tǒng)治療仍有約30%的患兒不能得到有效控制而發(fā)展成難治性癲癇［2］；顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是難治性癲癇的主要類型，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明［3］。有研究表明可能與腦組織調(diào)節(jié)分子異常、腦組織蛋白質(zhì)異常聚集等有關(guān)［4］。多效生長(zhǎng)因子或多效營(yíng)養(yǎng)因子（pleiotrophin，PTN）是從圍產(chǎn)期鼠腦組織中純化得到的一種肝素結(jié)合蛋白［5］。其主要生理功能是刺激細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)及骨發(fā)育等［6］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氯化鋰＆x100ccf;匹魯卡品誘發(fā)大鼠形成顳葉癲癇模型，通過觀察顳葉海馬和皮質(zhì)中pleiotrophin表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，來探討此神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)癲癇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取健康雄性SD大鼠幼鼠48只（出生11 d、清潔級(jí)、25～30 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)數(shù)字表法均分為實(shí)驗(yàn)組（24只）和對(duì)照組（24只）。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別又均分為2 h模型、3周模型、8周模型3組，每組8只。飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境，室溫19～22Ⅴ，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

1.2 方法

1.2.1 模型制作：所有模型組幼鼠腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg，生理鹽水配制）用以增強(qiáng)匹魯卡品的敏感性，24 h后，模型組腹腔注射匹魯卡品（30 mg/kg，生理鹽水配制），對(duì)照組幼鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，模型組在注射匹魯卡品30 min前腹腔注射苯巴比妥（25 mg/kg，生理鹽水配制）用以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致外周膽堿能反應(yīng)。每30 min給予匹魯卡品（10 mg/kg）腹腔注射，直到出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。每只大鼠匹魯卡品注射最大劑量限制在60 mg/kg，癲癇發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)按照Racine標(biāo)準(zhǔn)判定。癲癇發(fā)作的程度分級(jí)0級(jí)：無驚厥；Ⅴ級(jí)：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐；Ⅴ級(jí)：以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉的抽搐；Ⅴ級(jí)：?jiǎn)蝹?cè)前肢的陣攣、抽搐；Ⅴ級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起；Ⅴ級(jí)：雙側(cè)后肢強(qiáng)直、身體背曲強(qiáng)直、跌倒；90 min后模型組癲癇動(dòng)物發(fā)作級(jí)別均達(dá)到Ⅴ～Ⅴ級(jí)，給予地西泮（10 mg/kg）腹腔注射以終止癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作，分別于模型建立2 h、3周、8周時(shí)間點(diǎn)時(shí)處死各組大鼠。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理：模型組大鼠分別于癲癇模型后2 h、3周、8周處死大鼠，對(duì)照組等時(shí)間點(diǎn)處死，用10%水合氯醛按350 mg/kg腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。取鼠大腦顳葉皮質(zhì)和海馬組織在4%多聚甲醛中固定24 h、經(jīng)石蠟包埋后，海馬和皮質(zhì)切片，厚度約5 μm、部分液氮速凍，-80冰箱保存。造模過程中死亡鼠已從總鼠中排除。

1.2.3 免疫組化染色（SABC法）：檢測(cè)大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中PTN的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行。兔PTN多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司（貨號(hào)bs＆x100ccf;2444R），SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 Real＆x100ccf;time PCR：實(shí)驗(yàn)步驟按照操作流程進(jìn)行，檢測(cè)大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中PTN的表達(dá)。

1.2.5 圖像分析：每只大鼠測(cè)3張切片，每張切片海馬、顳葉皮質(zhì)分別隨機(jī)選取1個(gè)視野（×200），測(cè)量平均光密度（mean optical density，MOD）值；利用ExicyclerTM96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢測(cè)結(jié)果用±s表示，樣本均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察

對(duì)照組均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，模型組大鼠在給予匹魯卡品后出現(xiàn)點(diǎn)頭、咀嚼、眨眼、立須等面部痙攣動(dòng)作，隨后出現(xiàn)前肢陣攣、前肢陣攣伴站立，再發(fā)展為全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴站立、跌倒反復(fù)發(fā)作，90 min后均達(dá)到級(jí)發(fā)作，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)。

2.2 各組大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)pleiotrophin免疫組化結(jié)果

Pleiotrophin陽(yáng)性染色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，為棕黃色顆粒。對(duì)照組大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中pleiotrophin陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。模型組大鼠癲癇持續(xù)后2 h后海馬和顳葉皮質(zhì)pleiotrophin陽(yáng)性細(xì)胞顯著表達(dá)，而3周，8周陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸升高，8周達(dá)高峰，見圖1。2 h、3周，8周模型組海馬和顳葉皮質(zhì)中pleiotrophin陽(yáng)性細(xì)胞與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.006、0.007、0.000；0.008、0.003、0.000），見表1。

2.3 癲癇大鼠海馬和皮質(zhì)中PTN mRNA的表達(dá)

Real＆x100ccf;time PCR結(jié)果顯示：癲癇大鼠大腦顳葉皮質(zhì)2 h、3周、8周模型組PTN mRNA表達(dá)水平逐漸上升，8周達(dá)高峰，與其相應(yīng)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.005、0.007、0.000）。癲癇大鼠海馬2 h、3周、8周模型組PTN mRNA表達(dá)水平逐漸上升，8周達(dá)高峰，與其相應(yīng)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.007、0.009、0.000），見圖2、3，表2。

3 討論

癲癇是一種由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的以短暫腦功能異常為特征的慢性腦部疾?。?］，發(fā)病機(jī)制中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用不容忽視，在癲癇動(dòng)物模型中，許多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)增加，是癲癇發(fā)生的抑制因子。利用氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇模型，可較好的模擬人類癲癇行為學(xué)、電生理學(xué)和病理學(xué)等特點(diǎn)，是世界上業(yè)內(nèi)人士公認(rèn)的一種成熟的顳葉癲癇動(dòng)物模型［8，9］。pleiotrophin 與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子關(guān)系最密切，它的表達(dá)產(chǎn)物是一種分泌性生長(zhǎng)因子，可分泌到細(xì)胞外體液（包括血液）中，同肝素具有高親和性。具有刺激細(xì)胞增殖與遷移、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)及骨發(fā)育等功能［10］。自發(fā)現(xiàn)以來，因其在腫瘤發(fā)生中的重要作用而備受關(guān)注，在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也越來越受到重視，特別是與阿爾茲海默病中研究廣泛，但在癲癇中的研究較少。

圖1 免疫組化顯示應(yīng)用匹魯卡品后幼鼠海馬中PTN陽(yáng)性細(xì)胞和其臨近的皮質(zhì)中PTN陽(yáng)性細(xì)胞，而對(duì)照組海馬和皮質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，PTN在海馬和皮質(zhì)中從癲癇后2h～8周免疫染色陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)比例尺=100μmFig.1 Immunohistochemistry shows PTN positive cells in the hippocampus and adjacent cortex of immature rats following pilocarpineadministration. Faint immunoreactive staining of PTN is seen in the hippocampus and adjacent cortex of a control rat，while gradualincreased immunoreactive staining of PTN was observed in the hippocampus and adjacent cortex of a rat from 2 h to 8 weekspost seizure Scale bar = 100

表1 各組大鼠顳葉皮質(zhì)和海馬中pleiotrophin陽(yáng)性細(xì)胞M O D值比較（±s）Tab.1 Comparison of mean density of positive cells of pleiotrophin in hippocampus of rats among groups（±s）

表1 各組大鼠顳葉皮質(zhì)和海馬中pleiotrophin陽(yáng)性細(xì)胞M O D值比較（±s）Tab.1 Comparison of mean density of positive cells of pleiotrophin in hippocampus of rats among groups（±s）

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表2 Real＆x100ccf;timePCR檢測(cè)各組大鼠腦顳葉皮質(zhì)和海馬中PTN mR NA的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of PTN mRNA in the temporal lobe cortex and hippocampus of rats（±s）

表2 Real＆x100ccf;timePCR檢測(cè)各組大鼠腦顳葉皮質(zhì)和海馬中PTN mR NA的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of PTN mRNA in the temporal lobe cortex and hippocampus of rats（±s）

Groups PTN mRNA Cortex Hippocampus 2 hours control 1.00±0.07 1.00±0.03 2 hours experimental 2.02±0.17 2.77±0.20 3 weeks control 1.02±0.02 0.96±0.03 3 weeks experimental 3.24±0.15 4.12±0.13 8 weeks control 0.96±0.03 1.09±0.08

Wanaka等［11］研究顯示pleiotrophin在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，提示pleiotrophin可能與癲癇的發(fā)作有關(guān)；Kim等［12］研究表明pleiotrophin在海人酸誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中表達(dá)增加，證實(shí)pleiotrophin阻滯海人酸誘導(dǎo)的海馬癲癇的發(fā)生和抑制細(xì)胞凋亡，除此之外，在腦損傷、腦退行性變?nèi)缗两鹕⒑嗤㈩D病，多發(fā)性硬化和中風(fēng)中，pleiotrophin表達(dá)增高，也起到神經(jīng)保護(hù)作用，這為多種神經(jīng)功能紊亂方面疾病提供了有效的治療方法。本研究顯示在匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇模型中pleiotrophin在癲癇大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中表達(dá)明顯升高，這與以往研究結(jié)果相似，為下一步研究pleiotrophin在癲癇發(fā)作中的保護(hù)作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

圖3 R eal＆x100ccf;timePCR檢測(cè)大鼠海馬中PTN mR NA的表達(dá)Fig.3 Expression of PTN mRNA in hippocampus of rats

PTN與神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究較早，機(jī)制研究也較多。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PTN mRNA主要在大腦室管膜下層正在發(fā)育的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞以及室管膜細(xì)胞中表達(dá)［13］，表明PTN在大腦的神經(jīng)、血管母細(xì)胞分化中起著重要作用。成年后，PTN在大腦中的表達(dá)水平較出生時(shí)明顯降低，而主要集中在海馬和大腦皮層［14］。有研究表明，PTN增加具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)功能［15，16］。

綜上所述，癲癇后大腦顳葉皮質(zhì)和海馬pleiotrophin表達(dá)明顯增加并且持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，進(jìn)一步研究及揭示癲癇后pleiotrophin表達(dá)增加的機(jī)制，可能為癲癇治療提供新的思路。

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