華 凱，郭慶升，張善勇

(遼寧省人民醫(yī)院，沈陽110016)

頸椎病、頸椎管狹窄癥、胸椎管狹窄癥、椎管內(nèi)腫瘤等都會造成脊髓的慢性壓迫，進而導致脊髓功能嚴重受損，脊髓減壓是治療此類疾病最有效的方法。臨床中常遇到手術后脊髓壓迫癥狀短時間緩解后，隨即出現(xiàn)癥狀加重現(xiàn)象，目前考慮此種現(xiàn)象為脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)，會造成脊髓毀滅性的神經(jīng)功能受損［1～4］。鑒于 SCIRI對患者的損害嚴重，對其損傷機制的研究顯得尤為重要。2011年5月～2012年5月，我們建立兔不同程度的頸髓壓迫模型，減壓后檢測脊髓內(nèi)再灌注損傷標志物及凋亡神經(jīng)元，以明確再灌注損傷與脊髓壓迫程度的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭白兔96只由吉林大學基礎實驗動物中心提供，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限。飼養(yǎng)條件要求室溫22℃，分籠飼養(yǎng)，自由進食。實驗動物的處理方法均符合國家科學技術部頒發(fā)《關于善待實驗動物的指導性意見》［5］。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性脊髓壓迫模型 經(jīng)兔耳緣靜脈采用戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉，使其自由呼吸，切口局部及周圍組織使用0.5%利多卡因注射局麻。經(jīng)頸前方分離顯露頸5椎體，先使用手鉆在椎體上緩慢鉆孔，鉆透椎體后壁，然后在頸5椎體中央擰入一枚螺釘，透視顯示螺釘進入椎管內(nèi)20%左右時停止。術中監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)脊髓誘發(fā)電位有明顯變化。沖洗術區(qū)后關閉創(chuàng)口。術后第1個月，每1周擰入螺釘0.25 mm。術后第2～4個月，每2周擰入0.25 mm。術后第5個月以后，每1個月擰入0.25 mm。

1.2.2 動物分組 96只動物隨機分為A、B、C、D 4組，每組24只。A組:假手術組，頸5椎體上鉆孔后即關閉創(chuàng)口，不擰入螺釘。B組:椎管螺釘占位達50%時停止擰入，繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。C組:椎管內(nèi)螺釘占位達60%時停止擰入，繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。D組:椎管內(nèi)螺釘占位達70%時停止擰入，并繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。根據(jù)脊髓組織取材時間不同以上每組又分為2 個亞組(A1、A2 組，B1、B2 組，C1、C2 組，D1、D2組)，每組12只。使用改良 Tarlov評分系統(tǒng)［6］對各組實驗動物處死前評分，由一人單盲完成。

1.2.3 組織取材 A1、B1、C1、D1組動物均給予致死量的戊巴比妥鈉(200 mg/kg)，迅速取出頸5椎體所對應的脊髓節(jié)段。將中央部分切除經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，剩余組織使用液氮轉存于-80℃冰箱。A2、B2、C2、D2組耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(25 mg/kg)，自由呼吸，切口局部及周圍組織使用0.5%利多卡因注射局麻。A2組僅顯露頸5椎體后關閉創(chuàng)口。B2、C2、D2組顯露并迅速取出螺釘，關創(chuàng)。6 h后所有動物給予致死量的戊巴比妥鈉(200 mg/kg)，迅速取出頸5椎體所對應的脊髓節(jié)段，將中央部分切除經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋。剩余組織使用液氮轉存于-80℃冰箱。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)及超氧化物激酶(SOD)活性測定 組織勻漿后采用超聲細胞破碎儀破碎細胞，按1∶9配制成10%組織勻漿，勻漿介質為冰生理鹽水。10 000 g離心15 min，取上清凍存于-80℃?zhèn)錅y。SOD、GSH-px活性及MDA含量測定參照南京建成生物工程公司提供的測試和說明進行。

1.2.5 TUNEL凋亡染色 TUNEL試劑盒購自北京博奧深生物技術有限公司。石蠟切片厚度為4 μm，按說明書操作封片后熒光顯微鏡下觀察，每只實驗動物取3張切片，計算脊髓前角第Ⅷ、第Ⅸ板層TUNEL染色陽性神經(jīng)元數(shù)目，由1名病理醫(yī)師單盲觀察，結果取3張切片計數(shù)的平均值。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多組間兩兩比較采用SNK(Stundent-Newmall-Keuls)檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠處死前神經(jīng)功能評分 Tarlov評分A1、B1、C1、D1 組分別為(4.00 ± 0.00)、(3.08 ±0.44)、(2.33 ± 0.61)、(1.58 ± 0.27)分，A2、B2、C2、D2組分別為(4.00 ± 0.00)、(3.66 ± 0.24)、(2.91 ±0.08)、(1.75 ±0.20)分。A 組 Tarlov評分顯著高于B組、C組和D組(P均＜0.05)。B1、C1、D1組Tarlov評分依次減低，組間有統(tǒng)計學差異(P均＜0.05)。B2、C2組 Tarlov評分高于 B1、C1組，組間有統(tǒng)計學差異(P均＜0.05)。

2.2 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及GSH-px、SOD活性 見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及SOD、GSH-px活性比較(±s)

表1 各組大鼠脊髓組織中MDA含量及SOD、GSH-px活性比較(±s)

注:與 A1組比較，aP ＜0.05;與 D1組比較，bP ＜0.01

組別 n M D A(n m o l/m g) S O D(U/m g) G S H-p x(U/m g)A 1組1 2 4.0 1 ±0.5 3 1 0 1.1 2 ±1 2.1 7 1 2.1 1 ±1.2 8 A 2 組 1 2 4.2 3 ±0.9 8 1 1 2.5 2 ± 9.8 2 1 3.5 2 ±2.0 1 B 1 組 1 2 5.4 3 ±0.3 7 a 9 0.3 5 ± 6.4 5 a 1 1.2 1 ±0.9 8 a B 2 組 1 2 5.6 9 ±1.0 8 8 8.2 9 ± 5.3 3 1 0.5 7 ±1.2 0 C 1 組 1 2 6.2 2 ±0.7 8 a 8 1.1 8 ± 4.3 8 a 9.4 8 ±0.8 7 a C 2 組 1 2 6.3 2 ±1.1 8 7 5.2 7 ± 5.5 7 8.9 3 ±0.7 1 D 1 組 1 2 6.5 1 ±0.5 6 a 7 8.4 5 ± 4.9 0 a 6.5 5 ±0.4 5 a D 2 組 1 2 8.9 1 ±1.5 2 b 6 1.2 3 ± 3.8 8 b 3.8 6 ±0.6 2 b

2.3 凋亡神經(jīng)元計數(shù) A1組、A2組未見TUNEL染色陽性神經(jīng)元;與A1組相比，B1、C1、D1組陽性細胞數(shù)目逐漸增加，各組之間均有統(tǒng)計學差異(P均＜0.05)。A1 與 A2、B1 與 B2、C1 與 C2、D1 與 D2組比較無統(tǒng)計學差異(P均＞0.05)。見圖1。

3 討論

圖1 各組TUNEL染色陽性神經(jīng)元計數(shù)

脊髓受壓后缺血缺氧，常導致脊髓神經(jīng)細胞死亡或凋亡［7，8］。手術解除壓迫是治療脊髓壓迫性疾病最直接也是最重要的方法。Nassr等［3］報道的連續(xù)750例多節(jié)段脊髓受壓的頸椎病，減壓手術后6.7%的患者出現(xiàn)了單個或多個神經(jīng)根麻痹的現(xiàn)象，其中19%轉變成永久性損害。脊髓長時間受到壓迫，處于慢性缺血缺氧狀態(tài)，而減壓對于慢性受壓脊髓是一種瞬時改變，減壓術后即可見脊髓搏動，脊髓血液灌注相對于減壓前迅速增加。目前認為脊柱減壓手術后SCIRI是癥狀加重的主要原因。

本實驗中通過建立脊髓慢性壓迫模型發(fā)現(xiàn)，當螺釘在椎管內(nèi)占位達到50%時出現(xiàn)輕微的行為學改變，隨著螺釘?shù)牟粩噙M入，實驗動物的脊髓受壓癥狀迅速加重。當椎管內(nèi)占位達到60%以后，即使輕微的增加螺釘?shù)倪M入即可明顯地加重脊髓損傷癥狀，這與既往研究結果基本一致［9～11］。螺釘取出后，椎管內(nèi)占位達50%和60%的實驗動物神經(jīng)功能明顯恢復，而椎管內(nèi)占位達70%的實驗動物神經(jīng)功能恢復不明顯，其中1只動物出現(xiàn)螺釘取出后神經(jīng)功能惡化的現(xiàn)象。這與臨床上發(fā)現(xiàn)的脊髓減壓后神經(jīng)功能惡化發(fā)生于脊髓壓迫嚴重的患者相一致［12］。

脊髓中脂質含量豐富，更易受到活性氧的攻擊。壓迫導致缺血使神經(jīng)細胞線粒體氧化還原酶系脫耦聯(lián)，產(chǎn)生大量氧自由基，后者易攻擊脂質引發(fā)過氧化反應，MDA是脂質過氧化的最終產(chǎn)物，測定MDA可直接反映自由基水平，反映SCIRI的程度［13］。SOD除通過催化O-2歧化反應，發(fā)揮抗氧自由基外，還可增強H2O2濃度的調(diào)節(jié)功能保護組織細胞，能抵御自由基對細胞的破壞，保持細胞膜的完整性，SOD活性可反映機體對氧自由基清除能力的高低。GSH-Px能夠減少氧化反應中羥基產(chǎn)生，是脊髓組織中清除過氧化物的重要酶類。本研究中，脊髓組織中MDA含量隨著脊髓壓迫程度的增加而增加。說明隨著脊髓壓迫程度的增加，產(chǎn)生脊髓循環(huán)障礙，微血管栓塞，神經(jīng)元線粒體功能障礙，線粒體氧化還原酶系脫耦聯(lián)，產(chǎn)生過多氧自由基，后者易攻擊脂質引發(fā)過氧化反應。當解除螺釘壓迫后，MDA含量較之前有不同程度的提高，且提高程度與壓迫水平呈正相關。當螺釘在椎管內(nèi)占位達到椎管徑線的70%時，減壓后脊髓中MDA增高顯著，與減壓前比較有統(tǒng)計學差異。反映減壓后脊髓供血供氧突然增加，通過多種途徑使氧自由基迅速增加，使脂質過氧化，MDA產(chǎn)生過多。MDA在各組中的變化說明了慢性脊髓壓迫減壓后SCIRI的存在，而且其損傷程度隨壓迫程度增加而增加。

本實驗中凋亡神經(jīng)元隨脊髓壓迫程度加重而增多，而減壓前和減壓后比較，凋亡神經(jīng)元數(shù)量無差異，考慮可能與減壓后觀察時間過短有關。

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