洪 燕 ，韓燕全 ，羅 歡 ，桂 潔 ，張 凱 ，姜 輝

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031）

我國(guó)約有1億左右乙型病毒性肝炎（HBV）攜帶者，肝硬化的發(fā)病率逐年增高［1-2］。肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)之路，因此阻止肝纖維化的發(fā)展，對(duì)于肝硬化的防治至關(guān)重要。中醫(yī)藥對(duì)肝纖維化的治療有較明顯的優(yōu)勢(shì)，中藥重樓臨床應(yīng)用于抗乙肝病毒合劑等多個(gè)治療慢性乙型肝炎的方劑中，其保肝、抗病毒療效確切［3］。課題組前期進(jìn)行了重樓對(duì)化學(xué)性及免疫性肝損傷小鼠的實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)對(duì)重樓保肝作用的有效部位進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明重樓對(duì)急性肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用，皂苷為其主要有效部位［4-6］。本文通過(guò)重樓皂苷干預(yù)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的實(shí)驗(yàn)，探討其抗纖維化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 重樓皂苷為實(shí)驗(yàn)室自制，以薯蕷皂苷元為對(duì)照，按紫外分光光度法于408nm測(cè)定其含量為54.23%；參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010版對(duì)其有效成分進(jìn)行測(cè)定，本品含重樓皂苷Ⅰ和Ⅱ總量為0.83%。復(fù)方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司），秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）及羥脯氨酸（HYP）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，批號(hào)分別為：C009-2，C010-2，75024R，59624R，78025R，75263R，A030-2。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)SD雄性大鼠，體重（200±20）g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 安捷倫8453-E型紫外分光光度計(jì)（安捷倫儀器有限公司），JW3021HR離心機(jī)（安徽嘉文），GL-88B漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司），DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發(fā)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為7組，即：正常組、模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組和重樓皂苷高、中、低劑量組，每組各10只。除正常組外，其他各組大鼠采用經(jīng)典的CCl4致肝纖維化造模。具體方法為：按0.1mL/100g體重皮下注射 CCl4橄欖油溶液（CCl4∶橄欖油=5∶5），2次/w，共 12w，正常組皮下注射橄欖油［7-8］。

1.2.2 給藥 第7周起，各組每天灌胃1次；正常組灌胃蒸餾水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，即秋水仙堿組劑量為0.1mg/kg，復(fù)方鱉甲軟肝片組劑量為540mg/kg，重樓皂苷高、中、低劑量組劑量分別為300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 末次給藥后，禁食8h，處死大鼠，取血，離心機(jī)分離血清，-20℃保存。稱取肝組織300mg，-20℃保存。用ELISA法分別檢測(cè)各指標(biāo)。血清ALT、AST含量測(cè)定：檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ含量測(cè)定：檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。肝組織HYP含量測(cè)定：組織解凍后，用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿，檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。肝組織病理觀察：取肝組織0.5g～1g，常規(guī)固定包埋，HE染色，普通光鏡觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST和肝組織HYP含量的影響

與正常組比較，模型組血清ALT、AST含量，肝組織HYP含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，各治療組血清ALT、AST含量，肝組織HYP含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠ALT、AST、HYP的影響 （±s）

表1 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠ALT、AST、HYP的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L） HYP（μg/L）正常組 10 - 50.06±7.26 41.99±10.95 220.28±41.87模型組 10 - 96.81±23.122） 89.87±18.222） 380.45±76.442）復(fù)方鱉甲軟肝片組 10 540 70.29±13.892） 72.21±10.582） 238.25±68.202）秋水仙堿組 10 0.1 71.33±9.782） 64.30±15.872） 266.86±54.242）重樓皂苷高劑量組 10 300 72.14±7.122） 66.17±12.162） 261.03±55.812）重樓皂苷中劑量組 10 150 76.81±12.572） 75.51±4.611） 292.95±49.942）重樓皂苷低劑量組 10 75 79.25±9.351） 76.72±6.731） 314.17±46.571）

2.2 血清ALT、AST、肝組織HYP與肝纖四項(xiàng)相關(guān)性分析［9］

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 ALT、AST、HYP與肝纖四項(xiàng)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明：ALT、AST、HYP與肝纖4項(xiàng)指標(biāo)之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量的影響

與正常組比較，模型組血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理的影響

正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)則；模型組局部肝細(xì)胞脂肪變性明顯，形態(tài)不規(guī)則，排列雜亂，且有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間有大量纖維增生，有假小葉形成；復(fù)方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度有所減輕，仍能觀察到脂肪樣變性肝細(xì)胞；重樓皂苷高劑量組肝小葉可見(jiàn)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪變性，纖維增生不明顯，與秋水仙堿組病變相當(dāng)；重樓皂苷中、小劑量組纖維增生，特別在小劑量組中可見(jiàn)纖維環(huán)繞，似假小葉存在，組織仍以肝細(xì)胞脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病變。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表3 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠肝纖四項(xiàng)的影響 （±s）

表3 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠肝纖四項(xiàng)的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（mg/kg） HA（ng/L） LN（μg/L） CⅣ（μg/L） PCⅢ（μg/L）正常組 10 - 87.75±14.122） 96.82±15.832） 69.57±8.472） 68.31±6.992）模型組 10 - 180.35±14.82 226.54±41.28 115.35±17.07 97.73±13.59復(fù)方鱉甲軟肝片組 10 540 96.83±9.832） 152.91±25.892） 77.09±19.012） 82.55±10.182）秋水仙堿組 10 0.1 97.22±11.682） 104.70±17.002） 80.51±26.522） 77.61±7.182）重樓皂苷高劑量組 10 300 123.28±11.452） 108.80±13.752） 86.42±21.242） 68.86±4.142）重樓皂苷中劑量組 10 150 124.50±17.722） 148.35±4.212） 93.68±21.441） 82.11±7.712）重樓皂苷低劑量組 10 75 117.99±37.952） 168.47±20.672） 114.83±14.08 85.26±14.791）

圖1 重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理的影響（HE×400）

3 討論

重樓為百合科草本植物，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效［10］。現(xiàn)代研究表明其藥理作用廣泛，如抗腫瘤、抗病毒、止血、消炎等作用。目前對(duì)重樓的研究多關(guān)注其抗癌方面的作用，而對(duì)肝纖維化方面的研究筆者至今未見(jiàn)報(bào)道。

課題組前期進(jìn)行了重樓保肝實(shí)驗(yàn)和有效部位篩選研究，表明重樓提取物有較明確的保肝作用，而重樓皂苷為其主要有效部位。故本實(shí)驗(yàn)分別以中藥復(fù)方鱉甲軟肝片和西藥秋水仙堿作為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察重樓皂苷對(duì)肝纖維化大鼠血清及肝組織相關(guān)纖維化標(biāo)志物的影響，進(jìn)一步探討重樓對(duì)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用，為其開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，其病理基礎(chǔ)主要是肝組織中大量的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，而細(xì)胞外基質(zhì)主要來(lái)源于肝星狀細(xì)胞（HSC），研究認(rèn)為HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。激活的HSC分泌HA，釋放至血竇中，因此血清中HA的含量可以直接反映HSC的活化程度，也間接反映了肝纖維化的進(jìn)展。除了HA之外，LN、PCⅢ、CⅣ，也是反映細(xì)胞外基質(zhì)沉積程度的血清標(biāo)志物［11］，常合稱四者為“肝纖四項(xiàng)”。這些血清標(biāo)志物中，HA的特異性較高，其余并不是肝纖維化特有的，在肺纖維化、腎臟疾病中也可見(jiàn)異常升高。故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了血清ALT、AST的含量以及肝組織HYP的含量，并對(duì)指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，以便對(duì)肝纖維化做出更加客觀的診斷和評(píng)價(jià)。

ALT和AST是人體代謝過(guò)程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞變性壞死或細(xì)胞膜受到損害時(shí)，即可釋放入血。1%的肝細(xì)胞受到損害，可使血液中ALT的濃度增加1倍。因此，血液ALT水平是反映肝臟是否受到損害的敏感指標(biāo)，而AST升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重樓皂苷能顯著降低肝纖維化大鼠血清中ALT及AST含量，提示其能減輕肝纖維化進(jìn)程中的肝細(xì)胞損傷，對(duì)肝臟有一定保護(hù)作用。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ALT、AST 與 HA、LN、CⅣ、PCⅢ之間在0.01水平上顯著相關(guān)，隨著轉(zhuǎn)氨酶的降低，肝纖四項(xiàng)指標(biāo)也隨之降低。這一變化也與肝組織病理結(jié)果相一致，即光鏡下觀察HE切片，可見(jiàn)隨著這些血清標(biāo)志物的降低，肝纖維化程度有不同程度改善，重樓皂苷高劑量組改善程度與復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組相當(dāng)，中、小劑量組改善程度不及復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組。

在肝纖維化的形成和發(fā)展中，以膠原蛋白為主要成分的膠原纖維大量增生，肝組織HYP主要存在于膠原蛋白中，其含量可反映肝纖維化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重樓皂苷能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中HYP水平，且與血清HA、LN、CⅣ、PCⅢ具有相關(guān)性。顯然，同時(shí)檢測(cè)上述指標(biāo)，能更加客觀地對(duì)肝纖維化做出診斷和評(píng)價(jià)。

以上結(jié)果表明，重樓皂苷能保護(hù)肝纖維化大鼠的肝功能，減輕肝纖維化程度；且隨著肝功能的好轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)氨酶降低），肝纖維化指標(biāo)也有所改善，其作用機(jī)制也在進(jìn)一步研究中。

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