田知海,茅云翔,孔凡娜,李 超,張曉楠,徐奎鵬
(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)
條斑紫菜(Pyropiayezoensis)屬紅藻門(Rhodophyta)、紅毛菜綱(Bangiophyceae)、紅毛藻目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬(Pyropia/Porphyra)。條斑紫菜由于其重要的經(jīng)濟價值而被大規(guī)模栽培,同時該物種也是潮間帶藻類的模式物種,是開展抗逆分子機理研究的理想材料[1-2]。組織破碎是DNA制備的首要步驟,不同的破碎方法對制備效率和DNA質(zhì)量有顯著影響。目前,制備條斑紫菜DNA采用的組織破碎方法有:液氮研磨、石英砂研磨、海螺酶制備原生質(zhì)體和LiCl軟化紫菜組織4種方法[3-4]。液氮和石英砂研磨能有效的破碎紫菜組織,但耗費時間長、效率低;另外2種方法的優(yōu)點是能夠減少紫菜中豐富的多糖對DNA質(zhì)量的影響,但同樣操作時間較長。上述方法均不適合于大批量樣品的DNA制備,同時也難以保障所制備DNA質(zhì)量的均一性。近年來,條斑紫菜群體遺傳多樣性、品系鑒定等方面的研究不斷增多[5-9],在SSR、AFLP和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中需要高效率、質(zhì)量均一的DNA制備方法。
生物樣品均質(zhì)器采用“珠間碰撞技術(shù)”研磨樣品,能有效的研磨破碎不同材質(zhì)(細(xì)菌、骨頭等)的樣品提取DNA[10-11]。對樣品快速、強力的研磨不僅節(jié)約時間、提高DNA得率,而且可同時制備數(shù)十個樣品,避免了交叉污染,極大提高了DNA制備效率[12-13]。但是對于不同樣品,最佳研磨條件(研磨介質(zhì)、研磨時間、研磨速度)是不同的。本實驗使用Precellys 24生物樣品均質(zhì)器,通過比較DNA得率、純度、完整性以及PCR應(yīng)用、限制性酶酶切效果等指標(biāo),優(yōu)化建立了1套高效率制備條斑紫菜葉狀體高質(zhì)量DNA的技術(shù)方法。
1.1.1 生物樣品材料 新鮮材料:收集條斑紫菜葉狀體,吸水紙吸干表面水分,每50mg分裝成1份備用。干燥材料:將上述方法收集的50mg新鮮材料在60℃下烘干3h,烘干后質(zhì)量約為10mg。
1.1.2 器材和試劑
主要器材 Precellys 24生物樣品均質(zhì)器(法國Bertin)、恒溫水浴鍋、冰箱、天平、高速冷凍離心機、穩(wěn)壓電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計、PCR儀。研磨介質(zhì):鋼珠(Φ2.3mm)、陶瓷珠(Φ1mm)、玻璃珠(Φ0.5 mm)。上述3種研磨珠均購自上海奧然科貿(mào)有限公司;石英砂(0.270~0.707mm),購自上海國藥集團。
試劑 提取緩沖液:100mol/L Tris-HCl、50mol/L EDTA、500mol/L NaCl,pH=8.0;SDS溶液:20%W/V溶于無菌蒸餾水;蛋白酶K儲存液:20mg蛋白酶K溶于1mL超純水中,-20℃凍存;RNase A:10mg/mL,-20℃凍存;異丙醇:-20℃使用;乙醇:75%V/V,-20℃使用;TE溶液:10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH=8.0。
1.2.1 均質(zhì)研磨設(shè)計
1.2.1.1 不同介質(zhì)類型長時間處理 預(yù)實驗結(jié)果顯示均質(zhì)80s時,鋼珠對新鮮和干燥材料的破碎效果與液氮研磨相近,因此選用80s為研磨時間,對不同介質(zhì)類型、介質(zhì)體積和材料類型(新鮮材料、干燥材料)進行了條件優(yōu)化(見表1)。共24個實驗處理,每個處理設(shè)置3個平行。
干燥材料和研磨介質(zhì)共同均質(zhì)破碎,破碎完成后加入1mL提取緩沖液;新鮮材料中加入1mL提取緩沖液與研磨介質(zhì)共同均質(zhì)破碎。均質(zhì)條件為:轉(zhuǎn)速6 800r/min,時間20s/次,均質(zhì)4次。
表1 長時間處理條件下的研磨介質(zhì)類型和體積Table 1 Bead types and volumes for long time granding(80s)
1.2.1.2 以鋼珠為介質(zhì)不同的處理時間 實驗過程中發(fā)現(xiàn)均質(zhì)80s時,鋼珠對材料的破碎效果最好,能夠有效提取DNA,260/280比值符合要求,260/230比值較穩(wěn)定,但存在DNA降解的問題。組織細(xì)胞的有效破碎是提取核酸的前提。因此,本實驗又探索了以鋼珠為均質(zhì)介質(zhì),不同均質(zhì)時間的DNA制備效果,均質(zhì)時間為5、10、20、40s。樣品為干燥、新鮮2種,鋼珠體積為0.2mL,轉(zhuǎn)速為6 800r/min,每個處理設(shè)3個重復(fù)。
1.2.2 藻體破碎效果 樣品均質(zhì)處理完成后,用移液器取100μL均質(zhì)液,在顯微鏡下觀察、測量并拍照。每個研磨樣品隨機選擇3個視野,每個視野統(tǒng)計6個碎片長度,碎片長度以碎片長軸的長度計,每個研磨樣品共記錄18個數(shù)據(jù)。
1.2.3 DNA提取過程 DNA制備參照 Wattier的紅藻DNA提取方法[14],進行適當(dāng)修改。具體操作如下:
加入1mL提取緩沖液的EP管中,加入100μL SDS(20%W/V)、5μL蛋白酶 K(20mg/mL),混合均勻放入37℃恒溫水浴鍋中溫浴30min,每5min劇烈振蕩一次;16 200g,4℃離心15min,取上清約800μL移入新EP管中冰浴30min;16 200g,4℃離心15min,取上清加入0.7倍體積異丙醇(-20℃),輕輕混勻后-20℃過夜;16 200g,4℃離心30min。棄上清;加入1mL 75%(V/V)冷乙醇(-20℃)洗滌沉淀,8 600g,4℃下離心10min,上述洗滌過程重復(fù)3次;棄上清,沉淀風(fēng)干至無乙醇?xì)埩?;加?00μL TE溶液37℃溶解DNA。8 600g,4℃離心10min,取上清即為DNA溶液。加入1μL RNase A(10mg/mL),37℃水浴1h。-20℃保存。
1.2.4 DNA質(zhì)量及應(yīng)用性檢測
1.2.4.1 DNA得率和純度 用Nanodrop微量光度計測定DNA溶液在260、230、280nm的光吸收值,并測算260/280、260/230值和DNA濃度(ng/μL)。
DNA得率(μg/g)=DNA濃度(ng/μL)×DNA體積(μL)/(樣品質(zhì)量0.05g×1 000)。
1.2.4.2 DNA完整性檢測 1%瓊脂糖凝膠電泳,DNA上樣量為500ng。90V,30min穩(wěn)壓電泳,EB染色15min。凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
1.2.4.3 DNA應(yīng)用性檢測
PCR擴增 以制備的基因組DNA作為模板,進行PCR擴增實驗,驗證DNA產(chǎn)物是否可以應(yīng)用于PCR擴增實驗。目的基因為實驗室開發(fā)的SSR分子標(biāo)記,目的片段為242bp。正向引物primer1序列為(5’-ACCTGTCAATGTCTTCAACCAC)、反向引物primer2序列為(5’-TCAGTCTGGGATGTGTCGAG)。PCR體系為20μL:2×Mix 10μL、ddw 6.6μL、primer1(10μmol/L)0.6μL、primer2(10μmol/L)0.6μL、DNA(20ng/μL)1μL、BSA(10mg/mL)1 μL、Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.2μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min,35個循環(huán)(94℃30s、59℃30s、72℃45s),72℃10min,10℃永久保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,Marker為50bp ladder。電泳條件為95V,30min。EB染色15min,凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
DNA限制性內(nèi)切酶酶切 對基因組DNA產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶進行酶切,檢驗DNA制備條件對酶切是否有影響。分別用限制性內(nèi)切酶TaqI和PstI進行酶切。酶切體系:1μg DNA樣品、2μL H buffer(10×)、2μLTaqI(10U/μL)或2μLPstI(15U/μL)、去離子水補足20μL。TaqI酶切條件:65℃8h,10℃保存;PstI酶切條件:37℃8h,65℃15min,10℃保存。取10μL酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果,EB染色15min,凝膠成像系統(tǒng)拍照。
2.1.1 不同介質(zhì)類型長時間處理 研磨80s時,不同體積的研磨介質(zhì)對樣品破碎效果基本一致;不同的研磨介質(zhì)對樣品破碎的效果有明顯的差異,鋼珠破碎效果最好,其次是陶瓷珠,最差的是玻璃珠;干燥材料和新鮮材料破碎程度有差別(見圖1)。
圖1 不同研磨介質(zhì)研磨干燥、新鮮材料破碎程度Fig.1 Fresh and dried samples grinded by different types of beads
干燥材料中,鋼珠能將紫菜葉狀體全部破碎成100μm以下的碎片;陶瓷珠組材料沒有完全破碎,破碎的碎片長度集中在100~400μm之間;石英砂和玻璃珠組中葉狀體基本沒有破碎,石英砂組中破碎的碎片長度100μm左右,玻璃珠組中沒有葉狀體碎片存在。新鮮材料中,鋼珠和陶瓷珠將紫菜葉狀體全部打碎,碎片長度在100μm以下;石英砂和玻璃珠組中葉狀體樣品基本沒有破碎,石英砂組破碎的材料碎片長度在100μm左右;玻璃珠組破碎的材料碎片長度一般在200μm左右。
2.1.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時間 在5、10、20、40s4個時間梯度下,鋼珠均能有效的破碎干燥材料和新鮮材料。干燥材料在研磨5~40s內(nèi)破碎效果一直。新鮮材料在研磨5~40s內(nèi),碎片長度隨著研磨時間的增長顯著性減小。干燥材料5s時的碎片長度集中在100~150μm之間;新鮮材料破碎5s時,碎片長度集中在800~1 000μm之間,見圖2。40s時碎片長度集中在200~300μm。
2.2.1 不同介質(zhì)類型長時間處理 研磨80s時,研磨介質(zhì)的體積對DNA產(chǎn)物完整性沒有顯著性影響。石英砂和玻璃珠組研磨干燥材料所得DNA完整性最好,4種研磨介質(zhì)研磨新鮮材料所得DNA出現(xiàn)降解,鋼珠和陶瓷珠組研磨干燥材料所得DNA基本全部降解,完整性最差(見圖3)。
圖2 鋼珠研磨5s后材料碎片F(xiàn)ig.2 The fractions of samples grinded with metal beads at 5s
圖3 80s研磨處理制備DNA電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by grinding 80s
2.2.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時間 在5、10、20、40s4個時間梯度下,利用鋼珠破碎的樣品能制備出完整性很好的DNA。干燥、新鮮2種樣品材料對DNA的完整性沒有顯著性影響。分子量21kb處各樣品間條帶基本相同;4kb處我們認(rèn)為可能是質(zhì)體和線粒體基因組DNA,隨著研磨時間延長這條帶不斷減弱。所以認(rèn)為鋼珠均質(zhì)5s時,干燥和新鮮材料制備的DNA完整性最好(見圖4)。
2.3.1 不同介質(zhì)類型長時間處理 研磨80s時,鋼珠、陶瓷珠研磨新鮮材料和玻璃珠研磨干燥材料時DNA得率隨著研磨介質(zhì)體積的增加有所增加,其他組DNA得率和研磨介質(zhì)體積關(guān)系不明顯。干燥材料在不同研磨介質(zhì)之間DNA得率沒有明顯差異;新鮮材料在不同研磨介質(zhì)之間DNA得率存在顯著性差異。鋼珠和陶瓷珠研磨時,新鮮材料DNA得率高于干燥材料DNA得率;石英砂和玻璃珠研磨時,新鮮材料DNA得率低于干燥材料DNA得率。干燥材料DNA得率集中在300~400μg/g之間;新鮮材料DNA得率由鋼珠、陶瓷珠、石英砂和玻璃珠依次減?。ㄒ妶D5)。
圖4 鋼珠處理不同時間制備DNA電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by metal beads with different grinding time
實驗結(jié)果顯示,研磨介質(zhì)體積差異與260/280值沒有顯著的相關(guān)性;260/230值隨著鋼珠和陶瓷珠體積的增加有所增加,隨著玻璃珠體積的增加有所減小,與石英砂體積沒有一定的正負(fù)相關(guān)性。
新鮮材料和干燥材料制備DNA的純度存在差異,鋼珠和陶瓷珠組中新鮮材料制備的DNA其260/280和260/230值均大于干燥材料制備的DNA;石英砂組新鮮材料制備的DNA其260/280小于干燥材料制備的DNA;玻璃珠組新鮮材料和干燥材料制備的DNA其260/280和260/230大小隨體積的變化而變化。
不同的研磨介質(zhì)所得DNA其260/280比值在1.8~2.0之間,說明蛋白質(zhì)被有效去除;石英砂研磨新鮮材料和玻璃珠研磨干燥材料所得DNA其260/230值大于2.0,多糖被有效去除;其余組260/230值在1.0~1.5之間,存在多糖污染。石英砂和玻璃珠不能有效的破碎樣品,可能影響后續(xù)的實驗操作,使多糖不能被穩(wěn)定的除去,造成DNA中多糖含量存在較大的差異(見表2)。
圖5 介質(zhì)類型和介質(zhì)體積對DNA得率的影響Fig.5 Effect of types and volume of beads on DNA yield
2.3.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時間 在5、10、20、40s4個時間梯度下,利用鋼珠破碎的樣品均能制備出DNA。干燥材料隨著鋼珠研磨時間的延長,DNA得率有所增加;新鮮材料隨著鋼珠研磨時間的延長,DNA得率沒有明顯變化。干燥材料在不同研磨時間下所得DNA純度基本一致,260/280值在1.8左右,260/230值在0.8~1.2之間;新鮮材料在不同研磨時間所得DNA純度基本一致,260/280值在1.8左右,260/230值在0.9~1.2之間。260/280比值平均值在1.8左右,說明DNA中蛋白質(zhì)被有效去除,DNA純度較高。260/230比值平均值在0.8~1.2之間,說明DNA中存在多糖等物質(zhì)污染(見表3)。
2.4.1 不同介質(zhì)類型長時間處理 研磨80s時制備的DNA,PCR擴增的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(見圖6)顯示所有條件下制備的DNA均能擴增出目的DNA片段。
2.4.2 鋼珠為均質(zhì)介質(zhì)處理不同時間 以鋼珠均質(zhì)5~40s制備的DNA為模塊,PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果(見圖7)顯示所有干燥材料和新鮮材料在5~40s研磨時間下制備的DNA均能擴增出目的DNA片段。
鋼珠研磨5~40s時制備的DNA,能被限制性內(nèi)切酶TaqI和PstI有效酶切(見圖8)。
表2 介質(zhì)類型和介質(zhì)體積對DNA純度的影響Table 2 Effect of types and volume of beads on the purity of DNA
表3 DNA純度與得率Table 3 Purity and yield of DNA
圖6 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification
圖7 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification
在研磨時間為80s時,干燥材料破碎效果最好的是鋼珠,最差的是玻璃珠。但是不同研磨介質(zhì)對干燥材料DNA的得率沒有顯著性影響,鋼珠研磨干燥材料時DNA得率為368μg/g,玻璃珠研磨干燥材料時DNA得率為352μg/g。原因是石英砂和玻璃珠在研磨干材料時,雖然沒有將干燥材料有效的破碎,但是高速的研磨過程中研磨介質(zhì)和樣品材料不斷碰撞,破壞了樣品材料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使DNA釋放出來。所以樣品材料沒有完全破碎沒有影響DNA得率。
圖8 DNA酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.8 Electrophoresis of genomic DNA digested with Pst I and TaqI endonuclease
在進行不同介質(zhì)類型長時間處理試驗中,從DNA的完整性講,石英砂和玻璃珠研磨干燥材料所得DNA完整性最好,4種研磨介質(zhì)研磨新鮮材料所得DNA都出現(xiàn)了嚴(yán)重的降解,鋼珠和陶瓷珠研磨干燥材料所得DNA降解最為嚴(yán)重。分析原因可能是干燥材料在石英砂和玻璃珠破碎時,雖然破壞了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),但是DNA沒有立刻釋放出來,減少了DNA與研磨介質(zhì)碰撞的機會,所以DNA完整性較好;而鋼珠和陶瓷珠因為密度大,研磨干燥材料時時作用力強,將樣品打碎的同時也會將DNA打斷,影響了DNA完整性;而新鮮材料研磨時隨著樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,DNA被釋放到提取液中,因此研磨介質(zhì)的碰撞可以將DNA打斷成小的片段;但同時因為DNA釋放到了溶液中,減小了研磨介質(zhì)對DNA的剪切力,所以DNA完整性比鋼珠和陶瓷珠研磨干燥材料時DNA降解程度小。
本方法利用Precellys 24高速介質(zhì)儀短時間研磨樣品,其優(yōu)點是:處理量大(每次24個樣品),處理時間短,樣品之間平行性好,樣品間無交叉污染。由于減少了樣品的損耗,同時有效破碎了樣品,所以DNA得率高。DNA得率在400~500μg/g之間,是其他研磨方法DNA得率的2~8倍[3-4]。同時,本方法5s就能對24個樣品進行有效的破碎,與液氮每5~10min研磨一個樣品相比,大大提高了工作效率。
利用4種研磨介質(zhì)、干燥和新鮮2種樣品材料、不同的研磨時間,優(yōu)化了條斑紫菜葉狀體DNA制備的方法。作者認(rèn)為破碎干燥和新鮮2種樣品材料制備高質(zhì)量條斑紫菜DNA的最佳條件為:研磨介質(zhì)為0.2mL鋼珠、研磨速度為6 800r/min、研磨時間為5s。
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