金怡雯，謝友坪，吳意珣，盧英華，敬科舉

（廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門361005）

螺旋藻（Spirulina platensis）是一種生長在熱帶及亞熱帶堿性湖泊中的微藻類植物，富含各種營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分［1］，被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織稱之為“21世紀(jì)人類最理想的天然保健食品”［2］.螺旋藻屬藍(lán)藻門（Cyomophyta）顫藻科（Oscilatoriaceae），又稱藍(lán)細(xì)菌，具有蛋白含量高、繁殖快等特點(diǎn)，藻粉中藻藍(lán)蛋白含量高達(dá)20%［3］.

藻藍(lán)蛋白是由脫輔基蛋白與藻藍(lán)膽素（開鏈線性四吡咯）共價結(jié)合而成，其基本結(jié)構(gòu)由α亞基（17 000u）和β亞基（19 500u）構(gòu)成單聚體（αβ），然后單聚體間通過連接肽構(gòu)成三聚體（αβ）3或者六聚體（αβ）6［4－5］.大量實(shí)驗(yàn)表明，螺旋藻藻藍(lán)蛋白具有提高人體免疫力［6］、促進(jìn)動物血細(xì)胞再生［7］、抑制癌細(xì)胞生長［8］等作用，同時在抗輻射、抗疲勞、清除自由基［9］等方面也具有一定的生理活性.目前國內(nèi)外對藻藍(lán)蛋白提取過程中細(xì)胞破碎方法主要有：化學(xué)試劑處理法、溶脹法、凍融法和超聲波法，其中凍融法和超聲法效果較好［10］.而Chen等［11］使用直接的滲透壓法也得到了較高的藻藍(lán)蛋白得率，且此法與其他方法相比操作簡單快捷.諸多因素影響螺旋藻藻藍(lán)蛋白的萃取效果，其中質(zhì)量濃度、萃取時間和萃取溫度對藻藍(lán)蛋白的萃取效果影響較為顯著［12］.本文對這3個因素進(jìn)行考察，用響應(yīng)曲面（response surface methodolo－gy，RSM）模型設(shè)計試驗(yàn)，對螺旋藻藻藍(lán)蛋白萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到藻藍(lán)蛋白的最佳萃取條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻株：螺旋藻（FACHB－314），購自中科院武漢水生生物研究所.

螺旋藻粉，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的螺旋藻體冷凍干燥所得；所有化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水.

FD－1000冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司；JA403電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；SKY－200B搖床，SUKUN；D－78532臺式冷凍離心機(jī)，ZENTRIFUGEN；UV－1800紫外可見分光光度計，SHIMADZU CORPORATION.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分析

取2～10mg／mL的螺旋藻粉，加入10mL磷酸鹽緩沖液（0.15mol／L，pH 值7.0），混勻后在某一固定溫度下靜置12～60h，離心（10 370 g，5min）后得到清透的藍(lán)色上清液，在620與652nm處測定液體的吸光度，根據(jù)下式［13］計算藻藍(lán)蛋白的濃度：

式中，ρ（C－PC），藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度（g／L）；A620，樣品在620nm處的吸光值；A652，樣品在652nm處的吸光值.

根據(jù)下式計算藻體中藻藍(lán)蛋白得率：

式中，Y，藻藍(lán)蛋白得率（%）；V，磷酸鹽緩沖液體積（L）；M，螺旋藻粉質(zhì)量（g）.

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1）萃取時間對藻藍(lán)蛋白得率的影響

在溫度為25℃，螺旋藻粉質(zhì)量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取時間對藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（a）所示，在萃取時間從12h增加到60h的過程中，藻藍(lán)蛋白得率先上升后下降.當(dāng)萃取時間為36 h的時候，藻藍(lán)蛋白得率達(dá)到最高值.隨著萃取時間的增加，螺旋藻細(xì)胞逐漸破碎釋放出自身的藻藍(lán)蛋白，所以其得率逐漸增加；當(dāng)達(dá)到一定的值后，再延長萃取時間，藻藍(lán)蛋白得率反而有所下降，這可能是因?yàn)殡S著萃取時間的延長，藻藍(lán)蛋白全部釋放出來之后發(fā)生一定程度上的自我降解.因此，選用36h作為藻藍(lán)蛋白萃取時間的最優(yōu)值做進(jìn)一步優(yōu)化.

2）萃取溫度對藻藍(lán)蛋白得率的影響

在萃取時間為36h，螺旋藻粉質(zhì)量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取溫度對藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（b）所示，萃取溫度在一定的范圍內(nèi)（13～37℃）呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在25℃時藻藍(lán)蛋白得率最高，達(dá)到13.37%.在萃取溫度從13℃升高到25℃的過程中，藻藍(lán)蛋白得率迅速上升，而超過25℃以后，變化不明顯甚至有略微下降.故選擇25℃為藻藍(lán)蛋白萃取的最佳溫度點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化.

3）質(zhì)量濃度對藻藍(lán)蛋白得率的影響

在萃取時間為36h，萃取溫度為25℃的條件下研究不同螺旋藻粉質(zhì)量濃度對藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（c）所示，在螺旋藻粉質(zhì)量濃度從2mg／mL增加到10mg／mL的過程中，藻藍(lán)蛋白得率變化較小，略微呈現(xiàn)少許的下降趨勢，這說明螺旋藻粉自身的質(zhì)量濃度可能相對于其他因素而言，對藻藍(lán)蛋白得率的影響較小.

1.2.3 RSM 試驗(yàn)設(shè)計

采用三因素的Box－Behnken設(shè)計（BBD）優(yōu)化萃取工藝參數(shù)，以質(zhì)量濃度、萃取時間和萃取溫度3個因素為自變量，藻藍(lán)蛋白得率為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平的RSM試驗(yàn).根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，規(guī)定了3個因素的變動范圍及中心點(diǎn)值（表1）.BBD有17個析因點(diǎn)，其中有5個重復(fù)的中心點(diǎn)（表2），采用Design Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

表1 Box－Behnken設(shè)計的因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box－Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert軟件對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到藻藍(lán)蛋白得率對3個因素的多元二次回歸模型：

2.2 RSM結(jié)果分析

從二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著（p＝0.000 6＜0.01）、失擬項(xiàng)不顯著（p＝0.135 2＞0.05）、R2＝0.955 0、＝0.897 1、CV＝4.37，這些數(shù)據(jù)表明回歸方程擬合度和可信度均很高，能很好地對最優(yōu)工藝條件進(jìn)行預(yù)測.

圖1 萃取時間（a）、萃取溫度（b）、質(zhì)量濃度（c）對藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig.1 Effect of different extraction time（a），extraction temperature（b），solid－to－liquid ratio（c）on extraction yield

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計與試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of Box－Behnken design

由回歸方程系數(shù)顯著性檢測結(jié)果可知，試驗(yàn)中一次項(xiàng) A 極 顯 著 （p 值 ＜0.01），B、C 顯 著 （p 值 ＜0.05）；二次項(xiàng)A2不顯著，B2、C2極顯著；交互項(xiàng)AB、AC不顯著，BC極顯著.

2.3 各因素之間的交互作用

根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)結(jié)果做RSM圖，考察擬合的RSM的形狀，分析螺旋藻粉質(zhì)量濃度、萃取時間、萃取溫度三者之間交互作用對藻藍(lán)蛋白得率的影響，其RSM和等高線如圖2～4所示.各因素及交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果以圖2～4直觀地反映出來.

圖2 質(zhì)量濃度與萃取時間對藻藍(lán)蛋白得率影響的RSM（a）及等高線（b）Fig.2 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction time on C－PC extraction yieid

從RSM中可以看出，萃取時間和萃取溫度之間的交互作用對藻藍(lán)蛋白得率的影響最為顯著，在姚毅等［14］、佟萬兵等［15］和孫長霞等［16］的研究結(jié)果中，萃取時間和萃取溫度之間的交互作用對所萃取物質(zhì)得率的影響也很顯著.從圖4可以看出，一定范圍內(nèi)，藻藍(lán)蛋白得率隨萃取時間和萃取溫度的增加而提高，兩者交互作用顯著.根據(jù)動力學(xué)理論，時間的延長有利于藻藍(lán)蛋白的充分?jǐn)U散析出，同時溫度的提高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動速率加快、水溶液黏度和傳質(zhì)阻力降低以及化合物之間的結(jié)合削弱，從而增加了藻藍(lán)蛋白的析出速率及其得率.因此，適當(dāng)增加萃取時間和萃取溫度有助于提高藻藍(lán)蛋白的得率.

另外，從圖3可以看出，質(zhì)量濃度和萃取溫度之間的交互作用對藻藍(lán)蛋白得率的影響次之.質(zhì)量濃度不變萃取溫度增加，藻藍(lán)蛋白得率逐漸增大到最大值然后下降；而萃取溫度不變質(zhì)量濃度增加，藻藍(lán)蛋白得率呈現(xiàn)略微下降的趨勢，這和之前單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析相吻合.Chaiklahan等［17］的研究表明，在螺旋藻多糖的萃取過程中質(zhì)量濃度越低多糖析出效果越好，因?yàn)楦叩暮坑欣诙嗵堑姆稚?，促進(jìn)多糖離開固體顆粒表面，同時增強(qiáng)了溶劑擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此提高了萃取效率，這和本文中藻藍(lán)蛋白得率隨質(zhì)量濃度增加而略微下降的結(jié)果相似.質(zhì)量濃度的增加并未取得更好的萃取效果，也可能是由于在萃取溶液中溶質(zhì)已達(dá)到完全飽和［18］.

2.4 優(yōu)化工藝結(jié)果

利用Design Expert軟件對模型方程求解，對回歸方程求一階偏導(dǎo)并使之等于0，解得A＝2.996，B＝－0.034，C＝1.716，為曲面最大點(diǎn)，所對應(yīng)各因子的量分別為螺旋藻粉質(zhì)量濃度2.00mg／mL，萃取時間37.14h，萃取溫度25.61℃，此條件下藻藍(lán)蛋白得率Y理論值為13.72%.

圖3 質(zhì)量濃度與萃取溫度對藻藍(lán)蛋白得率影響的響應(yīng)面（a）及等高線（b）Fig.3 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction temperature on C－PC extraction yieid

圖4 萃取時間與萃取溫度對藻藍(lán)蛋白得率影響的響應(yīng)面（a）及等高線（b）Fig.4 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of extraction time and extraction temperature on C－PC extraction yieid

按照模型預(yù)測的最優(yōu)條件，根據(jù)實(shí)際情況，在螺旋藻粉質(zhì)量濃度為2.0mg／mL、萃取時間為37.1h、萃取溫度為25.6℃的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到的藻藍(lán)蛋白得率（13.66±0.87）% （n＝3）和預(yù)測值吻合較好，表明該模型工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測實(shí)際情況.

相關(guān)研究表明，超聲波提取法藻藍(lán)蛋白得率為10.76%，凍融法藻藍(lán)蛋白得率為7.89%，以及恒溫浸提法藻藍(lán)蛋白得率為6.57%［12］.而采用本文優(yōu)化之后的直接滲透壓法藻藍(lán)蛋白得率可達(dá)到13.66%，該值要明顯高于文獻(xiàn)報道的結(jié)果.另外，優(yōu)化之前的萃取工藝條件為：質(zhì)量濃度10.0mg／mL、萃取時間21h和萃取溫度4℃，在此條件下萃取得到的藻藍(lán)蛋白得率為10.29%.與之相比較，萃取工藝條件優(yōu)化后其藻藍(lán)蛋白含量提高了32.8%.雖然萃取時間較長，但萃取溫度更接近室溫，因此降低了能耗，更節(jié)約成本.

3 結(jié) 論

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取質(zhì)量濃度、萃取時間和萃取溫度3個因素進(jìn)行RSM的Box－Behnken設(shè)計，采用Design Expert軟件進(jìn)行回歸擬合，建立藻藍(lán)蛋白得率工藝數(shù)學(xué)模型：Y＝12.74－1.36A＋0.44B＋0.59C ＋0.26AB ＋0.44AC －1.25BC －0.40A2－1.24B2－0.88C2.回歸分析表明，該模型的穩(wěn)定性較好；通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，萃取時間和萃取溫度的交互作用對藻藍(lán)蛋白得率的影響最為顯著.

2）由RSM試驗(yàn)，優(yōu)化了螺旋藻藻藍(lán)蛋白的萃取工藝，分析結(jié)果得到萃取的最佳工藝條件為：質(zhì)量濃度2.0mg／mL、萃取時間37.14h和萃取溫度25.61℃.在此條件下藻藍(lán)蛋白得率可達(dá)到13.66%，較優(yōu)化前提高了32.8%.

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